叶酸修饰的金属有机骨架装载抗肿瘤药5-FU的基础研究

摘要

金属-有机骨架（Metal-OrganicFrameworks，MOFs）是新型的多孔有机-无机杂化功能材料。MOFs具有其他材料都无法比拟的结构可裁性和易功能化的特性，由于其丰富的空间拓扑结构，相较经典的无机微孔材料，具有更高的比表面积，独特的光电磁等性质，在储H2和CO2等气体选择吸附方面显示重要应用前景。由于MOFs材料具有的多方面的优点，使MOFs的研究得到越来越多的关注。近年的研究表明，MOFs也显现出许多作为药物载体的特质，包括:适于包封药物的高的孔表面积和大的孔径;金属与配体间相对不稳定的配位键从而使MOFs具有的生物可降解性;运用合成后修饰手段可使其携带多种功能基团等。
　　 MOFs通常是在温和的条件下，通过络合作用以自组装的方式将金属离子与有机配体连接而形成。近年，国外学者（如:Ferey;WenbinLin等）对MOFs作为药物传递系统进行了初步研究，结果表明:MOFs可以同时实现高载药量和适宜的药物控制释放。例如，在含有Cr3+的MOFs中载入药物布洛芬，载药量可达0.220g/g载体，18d方可释药完全，但由于含Cr3+，限制了MOFs在体内的应用。鉴于人体组织中所含的金属元素，以Zn2+作为中心金属合成MOFs比较适宜用作药物载体的研究。
　　 叶酸是人体必需的维生素，它可参与细胞生长增殖过程中核苷酸碱基的合成，主要通过叶酸受体途径进入细胞，所以叶酸受体在生长旺盛的组织，特别是多种上皮系肿瘤细胞如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾丸癌、脑瘤、结肠癌、肺腺癌及口腔上皮癌KB细胞中高水平表达。由于叶酸具有无毒、免疫原性弱、稳定、与叶酸受体的结合力强、对肿瘤有高度选择性特点而成为重要的靶向制剂。大量研究表明，以叶酸受体作为肿瘤治疗的靶点，可增强抗肿瘤的疗效，减少对正常组织的损害，并有助于克服肿瘤细胞的耐药性。
　　 5-氟尿嘧啶(5-FU)为临床常用的抗代谢类抗肿瘤药物，主要用于胃、肠和肝等多种癌症的治疗。但本品有较强的毒副作用，MOFs可以同时实现高载药量和适宜的药物控制释放，可以延长5-FU在体内作用的时间和改善5-FU在体内半衰期短、毒副作用大等缺点，是抗肿瘤药良好的载体。但国内在这方面的研究尚未见文献报道。所以本课题在前人研究IRMOF-3的基础上，将IRMOF-3偶联叶酸后，选择5-FU为模型药物，考察其体外载药与释药特性，并研究体外细胞毒性和靶向性特点，为IRMOF-3作为药物载体的开发应用提供依据。
　　 目的：
　　 1、采用溶剂热法制备纳米级的金属有机骨架Zrn4O(C8H5NO4)3即(IRMOF-3)，并对IRMOF-3进行表征
　　 2、运用合成后修饰方法将叶酸连接至IRMOF-3表面，得到叶酸偶联的金属有机骨架(Folicacid-IRMOF-3)(FIR)，并对其偶联叶酸的处方工艺进行优化和对FIR表征分析
　　 3、FIR体外载药和释药的研究
　　 4、载药的FIR体外细胞毒性的研究和细胞靶向性的评价
　　 方法和结果：
　　 1、采用溶剂热法合成金属有机骨架IRMOF-3，并升温活化去除IRMOF-3中的DMF。选用X-射线粉末衍射(XRD)，红外光谱(IR)，扫描电镜(SEM)，热重分析(TG)对所得样品进行表征分析，测量IRMOF-3粒径大小，稳定性状况。结果表明得到的样品IRMOF-3结构正确，重复性良好，升温活化处理可将绝大多数有机溶剂DMF除去，IRMOF-3热稳定良好，平均粒径在200～300nm左右，形状为圆形或椭圆形且表面光滑完整，分布均匀。
　　 2、利用IRMOF-3中配体上的氨基基团与叶酸中羧基基团发生酰胺反应得到叶酸偶联的IRMOF-3(FIR)。对FIR采用核磁共振H谱(1HNMR)，IR，SEM和MS方法进行定性分析，并对其偶联叶酸的处方工艺采用正交实验法优化，以偶联率为主要考察指标，按L16(43)正交表设计安排试验，比较各因素极差R的大小和K值的大小，确定影响工艺的因素顺序和确定最佳工艺处方，从而选出最佳的实验条件。1HNMR，IR和质谱法(MS)的结果都显示FIR具有叶酸的化学位移和特征吸收峰，表明叶酸成功的偶联在IRMOF-3上，偶联叶酸后的FIR平均粒径大约为200～300nm左右，且分布均匀，形状为圆形或者椭圆型，偶联叶酸后载体的直径没有显著的变化。众多影响因素的主次顺序是:叶酸∶载体（质量比）＞反应时间＞反应温度;最佳处方条件即叶酸和载体的质量比为2:1，反应时间为2h，反应温度为40℃，这时的叶酸偶联率最高0.709g/g载体。
　　 3、按最佳偶联条件制备FIR并载入5-FU，以载药时间，载体和药物的质量比和载药量为指标，并对载药工艺条件进行优化，来确定最佳的载药条件，体外释药实验观察药物体外的释放效果。结果显示随着5-FU与载体FIR质量比的增加，即固定载体的量，增加药物5-FU的量，FIR的载药量随之增加，同时随着载药天数的增加，FIR的装载量也增加。析因分析结果显示:不同的载药天数对FIR的载药量有显著影响(F=145.398，P=0.000)，不同质量比对FIR载药量的影响也显著(F=18.167，P=0.000)，载药天数和质量比之间具有交互效应(F=4.499，P=0.001)。同时得出药物5-FU与FIR质量比为2:1时，载药时间为5d时，药物容量基本达到饱和，FIR的载药量达到最大。因此得到最优的载药条件为5-FU和FIR质量比为2:1，载药天数为5d。按照透析袋扩散法考察了载有5-FU的FIR的体外释放效果，所得释药曲线显示，在平稳释放的84h内，5-FU的释放量为55.3％，显示明显的缓释效果。
　　 4、细胞毒性实验以无叶酸培养液培养A549细胞（叶酸受体不表达细胞），Hela细胞（叶酸受体中表达细胞），KB细胞（叶酸受体高表达细胞）常规传代后，分别与不同浓度的5-FU组（阳性对照组）、IRMOF-3组、IRMOF-3载有5-FU组(5FU-IR，不接叶酸)、叶酸偶联IRMOF-3载有5-FU组(5FU-FIR，接有叶酸)孵化48h后，MTT法测定细胞存活率。
　　 多重分析结果显示在A549、Hela、KB三种细胞中，IRMOF-3组的细胞存活率和阳性对照5-FU组细胞存活率相比都有显著差异(P值均小0.05)，IRMOF-3组细胞毒性在同等浓度下小于5-FU组，说明IRMOF-3对细胞的生长影响较小，生物相容性较好。在三种细胞中5FU-IR组和5-FU组细胞存活率相比都无统计学意义（P值均大于0.05），这可能是因为5-FU和5FU-IR进入细胞的方式相同，细胞毒性相差不大，故细胞的存活率相比无统计学意义。
　　 多重分析结果同时显示:A549细胞是叶酸受体不表达细胞，5FU-FIR组不能通过叶酸受体进入细胞，和5-FU组进入细胞的方式相同，5FU-FIR组和5-FU组相比细胞存活率没有显著差异(P=0.379)。Hela细胞为叶酸受体中表达细胞，FIR偶联叶酸，对叶酸受体表达细胞有一定的靶向作用，但是可能是进入FIR孔中的5-FU有缓慢释放的过程，没有在48h内完全释放出5-FU，所以两组的细胞存活率也无显著差异(P=0.441)。KB细胞为叶酸受体高表达细胞，FIR能大量的通过叶酸受体进入肿瘤细胞，将5-FU快而准的带入细胞内，细胞的毒性大大增加，所以5FU-FIR组和5-FU组相比细胞存活率有显著差异(P=0.013)。
　　 5、为了评价5FU-FIR的细胞靶向性，本节实验以未经叶酸修饰的5FU-IR作为对照，以叶酸受体不同表达的三种肿瘤细胞:细胞表面叶酸受体高表达的KB细胞、细胞表面叶酸受体适度表达的Hela细胞，细胞表面叶酸受体不表达的细胞A549作为模型，分别将叶酸，5FU-FIR，5FU-IR与上述细胞孵化48h，MTT法测定细胞抑制率，考察叶酸对细胞生长的影响和研究5FU-FIR肿瘤选择性。
　　 体外细胞靶向性实验结果表明叶酸对此三种细胞生长没有显著影响。5FU-IR组在叶酸受体表达的细胞和不表达的细胞中，细胞抑制率均不受游离的叶酸的影响，因为5FU-IR组无偶联叶酸，不能通过叶酸受体介导，没有靶向性，故对游离叶酸不敏感。
　　 在叶酸受体不表达的A549细胞中，5FU-FIR不能和叶酸受体结合，只能全部通过被动的方式被吞入，所以和游离叶酸的浓度无关，组内不同叶酸浓度的细胞抑制率无显著差异(F=0.495，P=0.690)。但在Hela和KB细胞中，很低浓度游离叶酸存在时，极少量的叶酸受体被阻断，5FU-FIR还能通过剩下的叶酸受体到达细胞内部，随着外源性叶酸浓度加大，细胞中叶酸受体被外源性叶酸慢慢阻断，最后在高浓度游离叶酸时，叶酸受体被完全阻断，5FU-FIR只能通过被动方式被吞入，细胞毒性大大减小，细胞的抑制率也达到最低，因此在叶酸受体表达的细胞中，5FU-FIR组组内不同叶酸浓度的细胞抑制率有显著差异(Hela细胞中F=14.021，P=0.000，KB细胞中F=117.204，P=0.000)。
　　 5FU-FIR中偶联了叶酸，在叶酸受体表达的Hela细胞和KB细胞的细胞中，5FU-FIR组可以随着叶酸受体靶向进入细胞内部，而5FU-IR只能通过内吞等其他方式进入，细胞毒性小于5FU-FIR组，而A549细胞是叶酸受体表达阴性细胞，5FU-FIR组与5FU-IR组进入细胞的方式一样，不能由叶酸受体进入细胞，两组细胞抑制率无显著差异。综上所述，5FU-FIR具有细胞靶向性，与叶酸受体有高的亲和性，是抗肿瘤药良好载体。
　　 结论：
　　 本研究制备的纳米级金属有机骨架IRMOF-3大小合适，稳定性和重复性良好，电镜下观察形状为圆形或椭圆形，表面光滑且分布均匀。通过核磁共振H谱，红外光谱法和质谱法定性检测到叶酸成功偶联到IRMOF-3上得到FIR，正交实验法进行优化，得到了叶酸偶联的最佳工艺条件。FIR载入5-FU，通过优化载药条件得到具有较高载药量的FIR，且在体外有较好的缓释性，可以延长5-FU在体内作用的时间和改善5-FU在体内半衰期短，毒副作用大等缺点，体外细胞毒性和细胞靶向性试验说明载体IRMOF-3的细胞毒性在同等药物浓度下要小于5-FU细胞毒性，生物相容性好。叶酸偶联物5FU-FIR对叶酸受体表达的细胞有靶向作用，是抗肿瘤药良好的载体。
　　 本研究的创新点：
　　 金属有机骨架IRMOF-3合成简单，稳定性好，将其偶联叶酸后得到的FIR，具有大的孔隙和表面积，高的载药量和适宜的药物控制释放性质，且生物相容性良好，有肿瘤靶向作用，是抗肿瘤药良好的载体。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 IRMOF-3的合成和IRMOF-3偶联叶酸

第一节 IRMOF-3的合成

1 仪器与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

第二节 叶酸偶联IRMOF-3

1 仪器与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 FIR载药与释药

1 仪器与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 细胞水平评价5FU-FIR

第一节 细胞毒性的考察

1 仪器与试剂

2 方法

3 结果

3 讨论

第二节 体外的细胞靶向性试验

1 试剂和仪器

2 细胞靶向性试验

3 结果

4 讨论

全文小节

参考文献

缩写词中英文对照表

研究成果

致谢

声明

统计学证明