α1-受体抗体介导的糖尿病鼠肾基质重构免疫机制

摘要

糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是一种发病机制极为复杂的内分泌系统疾病，已成为继癌症、心血管疾病之后的第三大威胁世界人类健康的主要疾病。目前全球约有2.5亿DM患者，预计至2030年增加到4亿，中国已成为DM第一大国，且发病趋于年轻化。DM导致的大血管、微血管等并发症是严重威胁DM患者生活质量以及造成其致残和死亡的主要因素。DM病人的各个器官和脏器都受到不同程度的损害，尤其以糖尿病肾病（Diabeticnephropathy，DN）最具有危害性。DN的常规治疗包括严格调控血糖以及使用肾素-血管紧张素系统抑制剂严格控制血压。然而，在临床实践中，虽然应用上述治疗很好地控制了血糖和血压，仍有很多患者的肾脏未达到预期的保护目的。仅用血液动力学障碍、高血糖等方面解释DN是不充分的，免疫机制在其并发症的发病机制中占有重要地位。
　　 近年来发现，AT1、α1、β1、M2等受体自身抗体（Autoantibodies，AutoAb）阳性的患者即使血糖、血压控制在正常范围内，其DN发病率及病程进展方面都远远高于AutoAb阴性的患者。因此，我们推测DN发病可能与AutoAb有关，但此抗体(Antibodies，Ab)参与DN发病的肾脏改变机制尚不清楚。有研究提出把DN看作一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病。肾脏固有细胞在病理状态下可产生核因子-κB（NuclearfactorkappaB，NF-κB）、骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)、转化生长因子-β1（Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)等多种促炎症因子或炎症因子，这些因子又通过自分泌和旁分泌等方式使炎症效应不断的扩大，引起炎症的级联反应。其中，NF-κB起主要调节作用。活化的NF-κB不仅可以自身激活转化生长因子-α（Transforminggrowthfactor-α，TGF-α）、白细胞介素-1(Interleukin-1，TL-1)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)等导致肾小球肥大、肾小球率过滤增加、肾小球基底膜增厚、肾小球系膜细胞增生、炎症细胞的沉积、细胞外基质(Extracelluarmatrix，ECM)沉积等，活化的NF-κB还可通过诱导OPN、TGF-β1等炎症因子的产生引起炎症的级联反应，将炎症扩大化;OPN自身也可导致肾基质重构，例如早期肾实质的损伤造成肾小球滤过大量蛋白尿，进入肾小管通过OPN诱发肾脏间质炎性浸润;TGF-β1是目前公认的最重要的致纤维化因子之一，可从多方面促进ECM生成，同时抑制其降解，导致其过度集聚，最终引起相关组织的纤维化。正常情况下，NF-κB的以P50-P65组成的异二聚体的形式与抑制蛋白IKBa结合存在于几乎所有细胞的胞浆中，只有P65在核内极少表达维持正常的生理活动。而在TGF-β1、蛋白激酶C(ProteinkinaseC，PKC)等因子的激活下，P65移位至胞核，导致NF-κB大量表达。其中PKC为G蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptor，GPCR)下游的信号转导分子，而血清α1-肾上腺素能受体抗体(α1-Adrenergicreceptorantibodies，α1-RAb)为GPCR对应的Ab。
　　 GPCR是与GTP结合蛋白偶联的一组膜表面糖蛋白，其包括AT1、α1、β1、M2受体等，是涉及信号转导的细胞膜受体中最大的家族，介导的信号参与肾脏功能和调节免疫应答。GPCR由7个多肽链形成的跨膜亚单位构成，形成三个细胞外环和三个细胞内环的空间构象，α1-RAb为IgM或IgG型免疫球蛋白，主要针对α1-R胞外第二肽段的1922218氨基酸序列。研究发现，此GPCR受到反复刺激后可通过内化机制产生AutoAb，模拟正常的生理信号如血管紧张素（Angiotensin，AT）、肾上腺素，激动相应GPCR，发挥与血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，ATⅡ)、肾上腺素等相似作用。α1-RAb与受体结合后，可能通过α1-RAb→GPCR→PKC→NF-κB→TGF-β1或α1-RAb→GPCR→PKC→NF-κB→OPN→TGF-β1信号转导通路的激活调节肾皮质相关细胞增殖、分化、代谢等多方面的应答。所以，我们设计此实验，鼠尾静脉注射α1-RAb，研究此受体Ab介导后，通过激活GPCR继而活化NF-κB最终激活TGF-β1、OPN等炎症因子使炎症效应不断扩大，引起炎症的级联反应。随着炎症反应和免疫反应在DN进展中关键作用的确立，如何阻断DN并发症机制中这一关键环节，早期保护肾功能成为目前研究热点。免疫机制链接炎症因子导致肾基质重构及受体Ab阻断剂干预DN的发展目前尚未见报道。本实验建立DM大鼠模型，探讨α1-RAb与TGF-β1、OPN在DN进展中的重要作用及多沙唑嗪对其的相关影响，为临床治疗体内存在或高度表达自身Ab的患者提供了新的理论依据，也为将来开发DN的分子靶向治疗开拓了新思路。
　　 第一章α1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β1表达的影响
　　 [目的]
　　 观察α1-RAb的介导对DM大鼠肾皮质中TGF-β1表达的影响，通过探讨其在肾皮质病变中的发生发展，以阐明α1-RAb在肾基质重构中的作用。
　　 [方法]
　　 1.高脂饲料的制作:10％猪油，10％蔗糖，2.5％胆固醇，0.4％胆酸钠和77％基础饲料混匀后压粒即得。
　　 2.DM大鼠模型的制备与实验动物分组:Wistar大鼠适应性喂养一周后，称重，随机分为健康鼠空白对照组、健康鼠α1-RAb介导组、DM鼠无α1-RAb介导组及DM鼠α1-RAb介导组。DM鼠高糖高脂饮食喂养四周后，造模前禁食12h，后以体重0.5mL/100g体重腹腔注射配置好的无菌柠檬酸-链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)混合液[临用前用0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH=4.3)配成20g/L浓度]，72h后鼠尾静脉取血测定空腹血糖，血糖＞16.7mmol/L为造模成功。造模成功后:健康鼠α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射α1-RAb，100μg/100g体重;健康鼠空白对照组、DM鼠无α1-RAb介导组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射等量注射用生理盐水。DM鼠组造模成功后改为普食喂养至实验结束。对照组全过程普食喂养。实验期间，保持室温18-20℃，湿度69％，12h交替照明，大鼠自由饮水、进食。
　　 3.疗效观察与检测:
　　 ①一般情况的影响:包括活动、精神状态、皮毛状况、摄食量、饮水量、大小便、体重等的观测。
　　 ②对大鼠24h尿白蛋白定量(24hoururineprotein，24hUpro)[放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA)]、血清肌酐值(Serumcreatinine，SCr)（苦味酸法）的影响。
　　 4.免疫组化法研究TGF-β1在正常大鼠和DM大鼠肾脏组织的分布和表达情况。
　　 5.电镜下观察各实验组肾组织近曲小管、远曲小管及肾小球的改变。
　　 [结果]
　　 1.32只大鼠用于造模，成模率100％(32/32)，成模后病死率为零(0/32)。
　　 2.16周介导后，健康鼠体重较介导前增多有显著性意义(P=0.000)，DM鼠体重较前减少有显著性意义(P=0.000)。
　　 3.16周介导后，健康鼠24hUpro增多有显著性意义（P=0.011或P=0.000）。DM鼠α1-RAb介导后SCr增多有显著性意义(P=0.000)，健康鼠α1-RAb介导后SCr差异无显著性意义(P=0.383)。
　　 4.由平均灰度、阳性单位评估TGF-β1表达程度。有或无α1-RAb介导的健康鼠组和DM鼠组肾皮质中均可见TGF-β1的表达，且α1-RAb介导组较无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P=0.000或P=0.001或P=0.006或P=0.010)。
　　 5.电镜下健康鼠空白对照组未见明显异常，健康鼠α1-RAb介导组及DM鼠无α1-RAb组可见轻度异常，DM鼠α1-RAb介导组微观结构严重的破坏。
　　 [结论]
　　 α1-RAb介导的鼠体肾皮质中TGF-β1表达增加，即TGF-β1的表达与α1-RAb介导的免疫反应有关。
　　 第二章α1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质骨桥蛋白表达的影响
　　 [目的]
　　 观察α1-RAb的介导对DM大鼠肾皮质中OPN表达的影响，通过探讨其在肾皮质病变中的发生发展，以阐明α1-RAb在肾基质重构中的作用。
　　 [方法]
　　 同第一章。
　　 [结果]
　　 由平均灰度、阳性单位评估OPN的表达程度。有或无α1-RAb介导的健康鼠组和DM鼠组肾皮质中均可见OPN的表达，且α1-RAb介导组较无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P=0.000)。余结果同第一章。
　　 [结论]
　　 α1-RAb介导的鼠体肾皮质中OPN表达增加，即OPN的表达与α1-RAb介导的免疫反应有关。
　　 第三章多沙唑嗪对血清α1-肾上腺素能受体抗体介导的糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β1表达的影响
　　 [目的]
　　 通过观察多沙唑嗪抑制α1-RAb介导的DM大鼠肾皮质中TGF-β1的表达，探讨其对α1-RAb介导的DM大鼠肾皮质中TGF-β1表达的抑制作用，来进一步阐明α1-RAb抑制剂是否可以通过降低促纤维化因子TGF-β1的表达，减轻肾基质重构，从而延缓DN的发生。
　　 [方法]
　　 1.高脂饲料的制作:同第一章。
　　 2.灌胃药物的制作:多沙唑嗪(4mg)，研磨成粉末状后按0.36mg/kg给药剂量、10ml/kg大鼠给药容量配置既得。
　　 3.DM大鼠模型的制备与实验动物分组:Wistar大鼠适应性喂养一周后，高糖高脂饮食喂养四周，造模前禁食12h，后以体重0.5mL/100g体重腹腔注射配置好的无菌STZ混合液[临用前用0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液(pH=4.3)配成20g/L浓度]，72h后鼠尾静脉取血测定空腹血糖，血糖＞16.7mmol/L为造模成功。造模成功后，称重，随机分为DM鼠无α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组及DM鼠多沙唑嗪干预组。DM鼠α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射α1-RAb，100μg/100g体重;DM鼠无α1-RAb介导组、DM鼠多沙唑嗪干预组在0、4、8、12、16周鼠尾静脉一次性注射等量生理盐水;DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组、DM鼠多沙唑嗪干预组按0.36mg/kg给药剂量、10ml/kg大鼠给药容量灌胃给药，DM鼠无α1-RAb介导组、DM鼠α1-RAb介导组给予相应体积的蒸馏水，1/d，连续16周。DM鼠组造模成功后改为普食喂养至实验结束。对照组全过程普食喂养。实验期间，保持室温18-20℃，湿度69％，12h交替照明，大鼠自由饮水、进食。
　　 4.疗效观察与检测:
　　 同第一章。
　　 [结果]
　　 1.48只大鼠用于造模，成模率100％(48/48)，成模后病死率为零(0/48)。
　　 2.16周α1-RAb介导后，DM鼠体重较前减少有显著性意义(P=0.000)。
　　 3.16周α1-RAb介导后，DM鼠α1-RAb介导组24hUpro、SCr水平较DM鼠无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P＜0.01);DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组24hUpro、SCr水平较DM鼠α1-RAb介导组减少有显著性意义(P＜0.01)。DM鼠多沙唑嗪干预组24hUpro较DM无α1-RAb介导组减少有显著性意义(P＜0.01)，SCr水平差异无显著性意义(P=0.249)。
　　 4.由平均灰度、阳性单位评估TGF-β1的表达程度。有或无α1-RAb介导的DM鼠肾皮质中均可见TGF-β1的表达，α1-RAb介导组较无α1-RAb介导组增多有显著性意义(P＜0.01)，α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组较α1-RAb介导组减少有显著性意义(P＜0.01)，多沙唑嗪干预组较无α1-RAb介导组减少有显著性意义(P＜0.01)。
　　 5.电镜下DM鼠无α1-RAb组可见轻度异常，DM鼠α1-RAb组微观结构严重破坏，DM鼠α1-RAb介导+多沙唑嗪干预组较DM鼠α1-RAb介导组显著好转，DM鼠多沙唑嗪干预组稍有异常。
　　 [结论]
　　 TGF-β1的表达与自身免疫有关。多沙唑嗪可抑制α1-RAb介导的DM鼠肾皮质中TGF-β1的表达。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 血清α1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β1表达的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论：

参考文献

第二章 血清α1-肾上腺素能受体抗体介导对糖尿病鼠肾皮质骨桥蛋白表达的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 多沙唑嗪对血清α1-肾上腺素能受体抗体介导的糖尿病鼠肾皮质转化生长因子-β1表达的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论：

参考文献

全文小结（Brief summary）

综述

攻读硕士期间成果

中英文对照缩略词表

致谢

声明

统计学证明