脾虚证线粒体氧化损伤以及线粒体基因及其表达改变的研究

摘要

目的：脾为后天之本，气血生化之源，在生命活动过程中占有重要地位。长期以来，脾虚证一直是人们研究的热点。线粒体是糖、氨基酸、脂肪酸最终氧化的场所，并将这些成分在氧化与磷酸化中所释放的能量储存在ATP中，可以为细胞的各种生命活动提供能量，因此线粒体有细胞的“动力工厂”之称。导师在1987年首先提出了“中医脾一线粒体”相关的这一理论，随着研究的深入，尤其近年来，中医证候动物模型研究的广泛开展，加之分子生物学的兴起，为更深入探讨“脾虚”的本质奠定了理论基础。关于脾虚与自由基的关系，己有不少研究证明，自由基损伤是脾虚证的病理基础之一，氧自由基产生可影响线粒体的呼吸功能，继而使mtDNA受到损伤。本研究以脾虚证模型大鼠组织中线粒体作为研究对象，运用健脾方药治疗脾虚模型大鼠，观察脾虚大鼠线粒体氧化损伤情况，线粒体膜电位等，从自由基医学角度来探讨脾虚与线粒体的关系，以及健脾方药的作用机制；以脾虚证患者外周血中线粒体作为研究对象，观察线粒体DNA损伤情况，从基因与转录水平阐述脾虚患者线粒体氧利用障碍的影响因素及发生机制，进一步探讨脾虚证与线粒体相关性的分子生物学机制。 方法：研究包括文献研究和实验研究。文献研究中，从古代中医对脾及脾虚的认识、现代中医对脾虚证的认识、线粒体与细胞的能量转换的现代研究及脾与线粒体相关性的研究进展等方面进行了详细的整理和总结。实验研究由两部分组成：第一部分选用SPF级SD大白鼠60只，随机分为六组，即正常对照组、脾虚模型组、四君子汤组、当归补血汤组、黄芪四君子汤组、当归补血汤合四君子汤组等，每组各10只。以破气苦降加饥饱失常法制造大鼠脾虚模型，各组大鼠除正常对照组外每日灌饲小承气汤煎剂60g/kg体重(20m1/kg体重)，隔日半量进食，自由饮水，造模15天结束。各药物治疗组均造模结束后给药30天。实验结束后观察大鼠的一般情况，检测大鼠肝、骨骼肌组织线粒体SOD、GSH-Px 活力、MDA 含量及肝、脾组织中膜电位水平。第二部分选择脾虚证患者40例，湿热蕴脾证患者10例，采用PCR直接测序法检测其外周血白细胞线粒体DNA ATP6 亚基基因序列突变情况，以及与8例正常人对照进一步检测线粒体DNA ATP6 亚基基因mRNA表达情况。 结果： 1．脾虚模型组大鼠出现了明显的体重减轻，消瘦，粪便时软、时溏，食量减少，游泳耐力下降，倦怠，懒动，蜷缩聚堆，眯眼，弓背等典型脾虚症状，但肛温无明显变化，各药物治疗组能减轻造模对大鼠的影响。 2．脾虚模型组大鼠肝、骨骼肌组织中线粒体SOD、GSH-PX 活力较空白对照组明显下降(P<0.01)，各药物治疗组 SOD、GSH-PX 活力较模型组显著升高(P<0.05或P<0.01)，升高的次序为：当归补血汤合四君子汤组>黄芪四君子汤组>四君子汤组>当归补血汤组。当归补血汤合四君子汤组与黄芪四君子汤组之间差异显著(P<0.05)，黄芪四君子汤组与四君子汤组之间差异显著(P<0.05)，四君子汤组与当归补血汤组之间差异显著(P<0.05)。 3.脾虚模型组大鼠肝、骨骼肌组织中线粒体MDA含量较空白对照组显著升高(P<0.01)，各药物治疗组MDA含量较模型组明显下降(P<0.05或P<0.01)，降低的次序为：当归补血汤合四君子汤组>黄芪四君子汤组>四君子汤组>当归补血汤组。当归补血汤合四君子汤组与黄芪四君子汤组之间差异显著(P<0.05)，黄芪四君子汤组与四君子汤组之间差异显著(P<0.05)，四君子汤组与当归补血汤组之间差异显著(P<0.05)。 4.脾虚模型组大鼠肝脏及脾脏组织中线粒体膜电位较空白对照组明显下降，差异显著(P<0.01)，各药物治疗组均较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)，升高的次序为：当归补血汤合四君子汤组>黄芪四君子汤组>四君子汤组>当归补血汤组。当归补血汤合四君子汤组与黄芪四君子汤组之间差异显著(P<0.05)，黄芪四君子汤组与四君子汤组之间差异显著(P<0.05)，四君子汤组与当归补血汤组之间差异显著(P<0.05)。 5.经统计脾虚证患者组总突变率为95％，脾胃湿热证组总突变率为100％。脾气虚证组总突变率为80％，其中同义突变率为33％，缺失率为20％，插入突变率为13％：气虚不摄血证组总突变率为100％，其中同义突变率为58％，缺失率为0，插入突变率为17％：脾阴虚证组总突变率为100％，其中同义突变率为0，缺失率为25％，插入突变率为25％；脾阳虚证组总突变率为100％，其中同义突变率为11％，缺失率为0，插入突变率为O；脾胃湿热证组总突变率为100％，其中同义突变率为40％，缺失率为0，插入突变率为0。 ①脾气虚证组 8550T、8599C 插入突变各1例，引起mRNA 阅读框架改变，发生率均为6.7％；A8555T、C8563T、C8575G、A8566G、A8567G点突变各1例，分别使编码氨基酸由组氨酸变为亮氨酸、组氨酸变为骆氨酸、脯氨酸变为丙氨酸、异亮氨酸变为结氨酸、天酰氨酸变为丝氨酸，发生率均为6.7％；A8564、A8566、C8560空缺失突变各1例，引起mRNA 阅读框架改变，发生率均为6.7％。 ②气不摄血证组8570T插入突变2例，引起mRNA 阅读框架改变，发生率17％；A8567G 点突变2例、C8552G 点突变1例，分别使编码氨基酸由天酰氨酸变为丝氨酸、丙氨酸变为甘氨酸，发生率分别为17％、8.3％。 ③脾阴虚证组共4例患者，分别为8608C插入突变1例，C8599空缺失突变1例，均引起mRNA阅读框架改变；C8649A点突变1例，T8602c 点突变1例，使编码氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸。 ④脾阳虚证组C9196T、C9199T点突变各4例，均使编码氨基酸由谷酰氨酸变为终止密码子，发生率均为44％。 ⑤脾胃湿热证组C9197T点突变3例、C9200T 点突变1例，均使编码氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸，发生率分别为30％、10％；G8885A点突变2例，均使编码氨基酸由精氨酸变为赖氨酸，发生率为20％。 6.正常人组的荧光生长曲线呈明显阳性；脾虚证各组和脾胃湿热证组荧光反应均弱于正常人组，差异显著(P<0.01)；脾气虚证组的荧光反应弱于脾阴虚证组(因病例数偏少，未进行统计学比较)和脾阳虚证组(P<0.01)；脾气虚证组荧光反应虽弱于脾胃湿热证组，但无统计学意义(P>0.05)；脾阳虚证组荧光反应弱于脾胃湿热证组，差异显著(P<0.01)。 结论： 1.饥饱失常加苦降破气法，是目前塑造脾虚动物模型较理想的方法之一。 2.脾虚模型大鼠组织线粒体中存在氧化抗氧化失衡，提示脾虚证和线粒体氧化损伤发生密切相关。 3.脾虚证大鼠组织的线粒体膜电位比配的降低说明脾虚证模型存在线粒体功能的损伤，脾虚证与线粒体膜电位密切相关。 4.气血双补法对于升高脾虚证大鼠组织中SOD，GSH-Px 活性，降低MDA含量，以及提高线粒体膜电位水平效果优于单纯补气健脾法，说明补气健脾方中加入补血养血，活血行血之剂后，能够明显增强补气的作用。 5.脾虚证患者存在mtDNA 碱基点突变、缺失或插入，并造成编码氨基酸组成以及阅读框架的改变，导致mtDNA损伤，进而基因表达的下降，使得生成功能异常或无功能的亚基蛋白而直接影响F<,0>F<,1>-ATPase 的活性，最终影响细胞的能量代谢，造成细胞能量供应不足。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分 文献研究

第一节 古代中医对脾的认识

1中医脾的解剖学认识

2脾的生理功能

3脾与志、液、体、窍、时的关系

第二节古代中医对脾虚的认识

1脾虚证的源流

2脾虚证的病因病机

第三节 现代中医脾虚证本质的认识

1脾虚证与消化系统关系的研究

2脾虚证与免疫功能关系的研究

3脾虚证与神经内分泌系统关系的研究

4脾虚证与能量代谢关系的研究

5脾虚证与微循环系统及血液流变学关系的研究

6脾虚证与微量无素含量关系的研究

7脾虚证的分子生物学研究

第四节 线粒体与细胞的能量转换的现代研究

1线粒体的结构

2线粒体的化学组成

3人类线粒体的基因组

4线粒体的半自主性

5线粒体蛋白质的合成

6线粒体的功能

第五节 脾与线粒体相关性的研究进展

1脾与线粒体相关理论的提出

2脾主运化与线粒体相关

3脾主肌肉四肢与线粒体相关

4脾主升清与线粒体相关

5脾主生血与统血与线粒体相关

第二部分 实验研究

实验一 健脾中药对脾虚模型大鼠线粒体氧化性损伤的影响

材料和方法

结 果

讨 论

实验二 脾虚患者mtDNA ATPaxe 6亚基基因及其基因表达改变的研究

第一节 脾虚患者mtDNA ATPaxe 6亚基基因改变的研究

第二节 脾虚患者mtDNA ATPaxe 6亚基基因表达的研究

结 语

参考文献

附录

在学期间发表论文情况、从事科研项目情况及学术交流情况

致谢