嗜热菌HB27的蛋白酪氨酸磷酸酶的折叠研究

摘要

本研究从嗜热菌T.thermophilus HB27中克隆了一个新的PTPase基因，并在大肠杆菌中成功地表达了可溶的、具有生物学活性的PTPase；建立了简单可行的纯化流程，获得了这个热稳定的蛋白，并对其生物化学性质和去折叠过程进行了详细的研究。具体实验内容及结论如下：
　　 1.利用生物信息学方法，预测PTPase的等电点为5.88，分子量为22.26 kDa，其氨基酸出现频率与Swiss-Prot蛋白质序列数据库中的结果存在一定差异，其中极性氨基酸占了55.8％；预测其疏水性最大值为2.433，最小值为-2.222，其中2～18，82～90和140～145位的氨基酸具有一定的疏水性；氨基酸序列同源性分析发现PTPase与来源于T.thermophilus HB8的Tt1001氨基酸序列100％相似，与大鼠PTPase(AAB23588)的氨基酸序列则只有30.5％的相似性；二级结构预测PTPase存在三种二级结构：α螺旋、β折叠和无规卷曲。进化树分析表明该蛋白在进化过程中分支为两类：微生物PTPase与动植物PTPase。
　　 2.以pNPP为底物，研究了不同的pH、温度和离子对PTPase活性的影响，结果显示其最适pH范围为3.6～4.0，最适温度为75℃。30℃和75℃时kcat/Km的值分别为1.77*104 M-1·s-1和6.68*105M-1·s-1。Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+和Ni2+对PTPase的活性都有激活作用，其激活能力依次下降；而Zn2+，Cu2+，Cl-和SO42-则表现出抑制效应。结果表明PTPase也许在帮助T.thermophilus HB27适应极端温度和特定的生存环境方面在体内发挥着重要的生理作用。
　　 3.脲、盐酸胍和SDS诱导PTPase失活都是可逆的单相反应过程，抑制效应与浓度和时间相关，其IC50值分别为2.65 M、0.24 M和11.27μM；它们均为混合型抑制，在二次作图中前两者表现为直线，而后者为抛物线型。光谱学结果表明脲诱导了PTPase协同性的两态去折叠转变，而低浓度的盐酸胍诱导并稳定了蛋白去折叠中间态；低浓度的SDS诱导了其三级结构的变化和α-螺旋结构的增加，高浓度的SDS稳定了PTPase的二级结构。
　　 4.Cu2+和Zn2+均显著地抑制了PTPase的活性，这种抑制与离子浓度和作用时间相关，其IC50值分别为15μM和8.34 mM；动力学研究表明它们均为混合型可逆抑制，失活过程是单相反应过程。光谱学结果表明它们诱导了PTPase的三级结构发生了变化，但并不影响其二级结构。EDTA无法使Cu2+失活的PTPase恢复活性，但添加DTT则能使其活性恢复到其天然态时的40％，推测PTPase活性位点的Cys残基很可能被Cu2+氧化，从而导致其活性丧失和三级结构发生变化。
　　 综上，本研究为理解这一新的热稳定性PTPase的耐热机制、折叠机理、结构和功能，并为构建高效耐热的工程菌及其工业化应用提供了一些有用的信息，同时，对以PTPase为药物作用靶标研发其抑制剂类药物，以期治疗与PTPase相关的人类疾病也有一定的参考意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号对照表

声明

第1章引言

1.1蛋白酪氨酸磷酸酶

1.1.1磷酸酶的分类及研究进展

1.1.2蛋白酪氨酸磷酸酶概述

1.1.3蛋白酪氨酸磷酸酶家族及其分类

1.1.4蛋白酪氨酸磷酸酶的生理作用

1.1.5蛋白酪氨酸磷酸酶与疾病

1.1.6以蛋白酪氨酸磷酸酶为靶点开发治疗药物

1.1.7蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂研究进展

1.2极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27

1.3蛋白质折叠

1.3.1蛋白质折叠研究的概况

1.3.2研究蛋白质折叠常用的技术与方法

1.3.3蛋白质的折叠机理

1.3.4蛋白质的体内外折叠

1.3.4蛋白质的变性与去折叠

1.3.5蛋白质错误折叠与疾病

1.4本文的研究目的和主要内容

第2章材料和方法

2.1实验材料

2.1.2实验仪器

2.1.2实验试剂

2.2实验方法

2.2.1生物信息学分析及预测

2.2.2重组蛋白酪氨酸磷酸酶的克隆、表达和纯化

2.2.3蛋白酪氨酸磷酸酶的活性测定

2.2.4酶促反应动力学常数的测定

2.2.5 pH对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

2.2.6温度对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

2.2.7金属阳离子和阴离子对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

2.2.8抑制动力学研究

2.2.9脲、盐酸胍、SDS变性实验

2.2.10内源荧光光谱实验

2.2.11 ANS结合荧光光谱实验

2.2.12远紫外圆二色光谱实验

第3章生物信息学分析蛋白酪氨酸磷酸酶的序列和结构

3.1引言

3.2结果

3.2.1蛋白酪氨酸磷酸酶氨基酸序列分析

3.2.2蛋白酪氨酸磷酸酶疏水性分析

3.2.3蛋白酪氨酸磷酸酶的氨基酸序列同源性分析

3.2.4蛋白酪氨酸磷酸酶二级结构的预测

3.2.5蛋白酪氨酸磷酸酶二级和三级结构预测分析

3.2.6蛋白酪氨酸磷酸酶的进化树构建

3.3讨论

第4章重组蛋白酪氨酸磷酸酶：表达，纯化和性质研究

4.1引言

4.2结果

4.2.1蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆和重组构建

4.2.2蛋白酪氨酸磷酸酶的表达和纯化

4.2.3酶促反应动力学常数

4.2.4 pH对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

4.2.5温度对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

4.2.6金属阳离子和阴离子对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

4.3讨论

第5章脲和盐酸胍变性过程中蛋白酪氨酸磷酸酶的失活和去折叠研究

5.1引言

5.2结果

5.2.1脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

5.2.2脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响

5.2.3脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响

5.2.4脲和盐酸胍对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响

5.3讨论

第6章动力学和结构分析蛋白酪氨酸磷酸酶和SDS的相互作用

6.1引言

6.2结果

6.2.1 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

6.2.2 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶失活动力学的影响

6.2.3 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响

6.2.4 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响

6.2.5 SDS对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响

6.2.5序列同源建模和结构分析

6.3讨论

第7章反应动力学和光谱学研究Cu2+对蛋白酪氨酸磷酸酶的效应

7.1引言

7.2结果

7.2.1 Cu2+对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

7.2.2 Cu2+对蛋白酪氨酸磷酸酶三级结构的影响

7.2.3 Cu2+对蛋白酪氨酸磷酸酶二级结构的影响

7.2.4 EDTA和DTT对Cu2+失活的蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

7.3讨论

第8章Zn2+对蛋白酪氨酸磷酸酶活性和构象的影响

8.1引言

8.2结果

8.2.1 Zn2+对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响

8.2.2 Zn2+对蛋白酪氨酸磷酸酶内源荧光光谱的影响

8.2.3 Zn2+对蛋白酪氨酸磷酸酶ANS结合荧光光谱的影响

8.2.4 Zn2+对蛋白酪氨酸磷酸酶远紫外圆二色光谱的影响

8.3讨论

结 论

参考文献

在读期间的研究成果

致 谢