肠神经胶质细胞在溃疡性结肠炎炎症-肿瘤序列演进中的作用研究

摘要

目的：通过对AOM/DSS诱导的结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型腹腔注射肠神经胶质细胞（EGC）培养上清液进行干预，以及将EGC与小鼠肠上皮细胞(IEC-6)共培养，从体内体外两方面探讨EGC在溃疡性结肠炎炎症-肿瘤序列演进中的作用及可能机制。
　　方法：⑴采用随机数字表法将180只SPF级雌性BALB/C小鼠随机分为4组，即：A实验组（EGC+DSS），B条件对照组(DMEM+DSS)，C模型组（DSS）和D空白对照组（Control）。前三组给予AOM及2％DSS干预，构建结肠炎相关性结直肠癌小鼠模型，定时观察记录各组小鼠的一般情况，并进行疾病活动指数(DAI)评分。实验组从第4周开始每天腹腔注射EGC培养上清液100uL干预。各组分别在实验第1、3、4、6、7、9、12、15及20周末采用随机数字表法随机抽取5只小鼠采集外周血后处死小鼠，收集肠组织标本。外周血离心后收集血清标本采用抗体芯片检测炎症细胞因子水平，ELISA法检测NGF、GDNF细胞因子水平；肠组织标本测量长度并进行结肠大体损伤程度(CMDI)评分，HE染色并进行组织损伤程度(HS)评分，观察从溃疡性结肠炎炎症-不典型增生-肿瘤演进过程中的病理变化并统计成瘤率和瘤体数目（≥2mm）。免疫组化法检测 GFAP、S100β及PGP9.5等蛋白的表达，Western Blot法检测肠组织NF-κB、IKKβ、PI3K、AKT、PTEN及ZO-1等蛋白的表达。⑵利用Transwell小室共培养EGC和IEC-6细胞，在共培养系统加入TNF-a和IL-6细胞因子（30ug/ml）进行干预，通过荧光素渗漏实验检测EGC对IEC-6单层细胞屏障功能的影响，BrdU掺入法检测EGC对IEC-6细胞增殖的影响，流式细胞术检测EGC对IEC-6细胞周期及凋亡的影响，Western Blot法检测EGC对IEC-6细胞Caspase-3、Bcl-2、E-Cadherin及ZO-1等蛋白表达的影响。
　　结果：①DAI评分：与正常对照组对比，模型组DAI评分1W（0.67±0.62 vs0）、4W（0.80±0.73 vs0）、7W（1.00±0.85 vs0）、9W（0.67±0.47vs0.07±0.15）、12W（0.93±0.43 vs0.20±0.18）、15W（1.13±0.18 vs0.20±0.45）及20W（1.53±0.30vs0.07±0.15）均升高，差异有统计学意义（p＜0.05）；实验组与条件对照组对比各时间点差异均无统计学意义。②CMDI评分：与正常对照组对比，模型组CMDI评分1W（0.56±0.47vs0）、4W（2.37±1.57vs0）、7W（3.56±1.65vs0）、9W（2.86±0.99vs0）、12W（2.02±1.24 vs0）、15W（3.26±1.13 vs0）及20W（3.88±0.90vs0）均升高，差异有统计学意义（p＜0.05）；实验组与条件对照组对比7W（1.32±1.38vs3.96±1.49，p＜0.01）,20W（2.63±0.64 vs3.83±0.80，p＜0.05）减低，其余各时间点差异均无统计学意义。③HS评分：与正常对照组对比，模型组HS评分各时间点均升高，差异有统计学意义（p＜0.05）；实验组与条件对照组对比4W（8.84±1.10 vs10.66±1.25。p＜0.05）,7W（10.32±1.58 vs13.96±2.49，p＜0.05）减低，其余各时间点差异均无统计学意义。④结直肠长度：与正常对照组对比，模型组除3W（8.82±0.95 vs9.56±0.66。p＞0.05）外其余时间点结直肠长度均明显缩短，差异有统计学意义（p＜0.01）。实验组与条件对照组对比各时间点差异均无统计学意义。⑤成瘤率及瘤体数目（≥2mm）:实验组、条件对照组和模型组均从第6周末开始出现重度不典型增生及癌变，第6W成瘤率为50%，随时间延长逐渐升高，至第20W均达100%。第15W肿瘤数目（≥2mm）实验组vs条件对照组：3.17±1.72 vs5.83±2.04，p＜0.05；第20W肿瘤数目（≥2mm）实验组vs条件对照组：2.67±1.37vs5.67±2.58，p＜0.05。其余时间点差异无统计学意义。⑥抗体芯片结果显示：第4W开始实验组血清细胞因子TIMP-1（A/B由4W5.99倍降至20W0.00倍），M-CSF（A/B由4W3.48倍降至20W0.42倍），G-CSF（A/B由4W3.48倍降至20W0.39倍），IL-6（A/B由4W2.60倍降至20W0.44倍）逐渐降低。而MIP-1a（A/B由4W1.00倍升高至20W67.32倍），IL-2（A/B由4W078倍升高至20W3.67倍），BLC（A/B由4W1.30倍升高至20W2.95倍）逐渐升高。⒄ELISA法检测GDNF和NGF结果显示：实验组NGF在第4、9、15及20周较条件对照组升高（p＜0.05），GDNF从第6周开始较条件对照组均升高（p＜0.05）。⑧Western Blot结果显示：4W和6W实验组vs条件对照组ZO-1表达升高（p＜0.05）。其余时间点各组之间差异无统计学意义。⑨荧光素渗漏试验结果：IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6（724.33±22.08 vs1451.50±36.18，p＜0.01），IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a（1261.17±53.08 vs2623.50±62.77，p＜0.01）下室荧光素量均减少。⑩Western Blot结果显示：IEC-6+IL-6+EGC vs IEC-6+IL-6 ZO-1和E-cadherin表达升高（p<0.01），而IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a ZO-1和E-cadherin表达差异无统计学意义。IEC-6+TNF-a+EGC vs IEC-6+TNF-a Bcl-2表达升高（p<0.05），而在共培养体系加入IL-6 Bcl-2表达无差异。
　　结论：⑴成功构建AOM/DSS诱导结肠炎相关性结直肠癌实验动物模型。⑵在结肠炎炎症-肿瘤序列演进过程中，EGC可降低血清炎症细胞因子水平，升高血清NGF、GDNF水平，其机制可能与其抑制IKKβ/NF-κB有关。此外，可能通过调控PTEN-PI3K/AKT途径抑制上皮细胞凋亡，增加ZO-1表达从而降低肠粘膜通透性，减缓炎症-不典型增生-癌变的进程。⑶体外研究结果显示EGC可以促进肠上皮细胞的增殖，抑制其凋亡，并且通过促进紧密连接蛋白ZO-1和E-cadherin的表达维护肠粘膜屏障的完整性。

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前言

实验一 EGC在小鼠UC炎症-肿瘤序列演进中的作用研究

1材料与方法

1.1实验动物及细胞系

1.2主要实验仪器

1.3主要实验试剂

1.4实验方法

1.5统计学方法

2结果

2.1 EGC对DAI评分的影响

2.2小鼠炎-癌进程中结直肠长度的变化

2.3 EGC对CMDI和HS评分的影响

2.4 EGC对成瘤率及瘤体（≥2mm）数目的影响

2.5 EGC对血清炎症细胞因子水平的影响

2.6 EGC对血清NGF和GDNF水平的影响

2.7 EGC对肠组织GFAP、S100β、PGP9.5表达的影响

2.8 EGC对肠上皮紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

2.9 EGC对PTEN-PI3K/AKT信号转导通路的影响

2.10 EGC对IKKβ/NF-κB信号转导通路的影响

3讨论

实验二 在炎性环境中EGC对小鼠肠上皮细胞的影响研究

1材料与方法

1.1细胞系

1.2主要实验仪器

1.3主要实验试剂

1.4实验方法

1.5统计学方法

2结果

2.1 EGC对IEC-6单层细胞屏障功能的影响

2.2 EGC对IEC-6细胞增殖的影响

2.3 EGC对IEC-6细胞凋亡的影响

2.4 EGC对IEC-6细胞周期的影响

2.5 EGC对IEC-6细胞ZO-1、E-cadherin、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

3讨论

结论

参考文献

在学期间研究成果

综述:肠神经胶质细胞在炎症性肠病发生发展中作用的研究进展

致谢