荔枝TPEC高频率体胚发生及荔枝与龙眼原生质体融合研究

摘要

本研究以荔枝转基因原生质体再生的胚性愈伤组织(TPEC)细胞系为材料，优化荔枝TPEC长期继代保持的方法和条件；进行TPEC体胚发生的同步化调控，建立其高频率体胚发生的技术体系：通过POD和淀粉酶活性的测定，POD、EST同工酶酶谱变化分析，以及淀粉和可溶性总糖含量等生理指标测定，结合石蜡切片和透射电镜观察不同形态体胚的显微结构和超微结构等研究，进一步探讨荔枝TPEC体胚发生的机理；以荔枝TPEC细胞系中的Q81.535悬浮细胞为材料，优化荔枝TPEC高频率原生质体再生条件；并以荔枝TPEC细胞系中的Q81.535悬浮细胞和龙眼松散型胚性愈伤组织LC2为材料，采用PA-4000电融合仪进行荔枝与龙眼的原生质体融合的初步研究。主要研究结果如下： 1.荔枝TPEC长期继代保持条件的优化与体胚发生的同步化调控。采用在MS附加1mg·L-12,4-D与附加1 mg·L-12,4-D+50 mg·L-1潮霉素(Hygromyein B)的2种培养基交替继代培养，20天继代一次，荔枝TPEC细胞系交替继代培养了2年，保持了其抗性和体胚发生能力，生长状态良好，且其体胚发生能力均高于对照。采用附加0.3 mg·L-12,4-D、20 g·L-1和1 mg·L-12,4-D、50g·L-1蔗糖的MS培养基对荔枝TPEC进行同步化调控，经在附加5 mg·L-1ZT高糖(50g·L-1)高琼脂(10 g·L-1)的MS培养基上进行体胚分化，体胚大小基本趋于一致，同步化程度高，荔枝TPEC体胚发生的频率得到了很大的提高，并且在附加1 mg·L-12,4-D、50g·L-1蔗糖的MS培养基的同步化调控的效果优于附加0.3 mg·L-12,4-D、20 g·L-1蔗糖。 2.激素、渗透压调节物、天然附加物等对荔枝TPEC体胚发生及其成熟的影响。不同浓度的细胞分裂素(ZT、KT、6-BA)对荔枝TPEC体胚发生的影响存在差异，其对体胚发生所起作用的顺序为ZT>KT>6-BA。并确定荔枝体胚高频率发生的适宜培养基为附加3.0 mg·L-1ZT、附加50 g·L-1蔗糖、10 mg·L-1琼脂、100 mg·L-1肌醇：pH为5.8的MS培养基。在此培养基上体胚发生频率为100％，早期白色正常胚的比例达82％，个体较大，多为正常子叶胚：椰乳和龙眼汁对荔枝TPEC体胚的成熟有促进作用，其体胚正常成熟率分别为48.3％和45.6％；而ABA、BA、PEG均不利于荔枝TPEC体胚成熟，其体胚正常成熟率最高的达17.4％。 3.荔枝TPEC体胚发生机理的研究。①荔枝TPEC长期继代保持、体胚发生及其成熟过程中相关酶活性的研究。荔枝TPEC长期继代、体胚发生及其成熟过程中，POD活性总体呈下降趋势，分别在球形胚阶段和在成熟培养15天时出现两个峰值，且球形胚的POD活性最强；淀粉酶活性较低，α-淀粉酶与β-淀粉酶活性变化总体变化趋势都呈双峰型，但其峰值出现的时间不同；在不同细胞系之间，荔枝TPEC的4个细胞系的POD活性均高于对照；α-淀粉酶的活性低于对照，而β淀粉酶的活性高于对照。早期白色子叶胚与玻璃化胚、正常成熟与提早生根的成熟体胚之间POD和淀粉酶的活性也存在差异。②采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对荔枝TPEC继代、体胚发生及其成熟过程中POD与EST同工酶酶谱进行分析。荔枝TPEC不同细胞系之间、不同形态以及不同成熟时间的体胚的POD同工酶谱带既有酶带强弱的差异，又有带数的增减：EST同工酶具有稳定性，不同细胞系之间EST同工酶酶谱只有强弱的差异，没有谱带的变化，而在体胚发生及其成熟过程中EST同工酶出现两条新的谱带，其变化是相对稳定的，酯酶同工酶谱带条数不存在差异，只是表达量上的不同。③研究了荔枝TPEC体胚发生及其成熟过程中总糖和淀粉含量的变化。荔枝TPEC体胚发生和成熟过程中可溶性总糖含量的变化呈双峰型变化，峰值分别出现在球形胚阶段和成熟30 d；淀粉含量的变化趋势呈三峰型，峰值分别在球形胚、成熟培养15 d和60 d；早期白色子叶胚和玻璃化胚之间、提早生根与正常的成熟体胚之间可溶性总糖和淀粉的含量均存在差异。④采用石蜡和超薄切片的方法对荔枝TPEC体胚的显微和超微结构进行了研究。不同阶段、不同形态体胚的显微和超微结构均存在差异。荔枝TPEC早期白色子叶胚和正常成熟的体胚的细胞超微结构的特征是细胞形状比较规则，大小均匀，细胞内含物丰富；玻璃化子叶胚和提早生根的成熟胚细胞较大，细胞壁较薄，液泡很大，细胞核小，有核仁存在，核质较浓；细胞内含物较少。 4.荔枝与龙眼原生质体融合及其产物初步培养研究。荔枝TPEC细胞系Q81.535悬浮细胞系原生质体分离的适宜条件是：在不含潮霉素的交替继代培养基上悬浮培养6-8代的第5 d的悬浮细胞，用含纤维素和离析酶各1％的CPW-13M酶解液，在黑暗、25±2℃条件下，采用连续振荡(30-40 r-min-1)酶解10 h。在此条件下，荔枝TPEC原生质体产量最高达10.8×107个/g，活力最高达95.3％；以改良KM8P培养基中附加1.0mg·L-12,4-D、0.2mg·L-1NAA、0.5 mg·L-1BA、0.5 mg·L-1KT、50 mL·L-1椰汁、250 mg·L-1谷氨酰胺、0.45 M葡萄糖和0.1 M蔗糖为培养基，采用海藻酸钠盐包埋悬浮方式黑暗培养，使得高频率原生质体再生；以荔枝TPEC中细胞系Q81.535悬浮细胞和龙眼松散型胚性愈伤组织LC2为材料，采用PA-4000电融合仪进行荔枝龙眼原生质体融合的适宜条件是当原生质体密度为5×105个·mL-1时，选用交流电场的频率为1.0 Mhz、交变电场场强为50 V·cm-1，作用时间为60 s，直流脉冲强度为600 V·cm-1、脉冲持续时间为10 ms，脉冲2-3次，融合率可达30％以上。其电融合产物以改良KM8P为基本培养基，附加1.0 mg·L-12,4-D、0.2 mg·L-1 NAA、0.5mg·L-1BA、0.5 mg·L-1KT、50 mL·L-1CW、250 mg·L-1谷氨酰胺、0.45 M葡萄糖和0.1 M蔗糖进行初步培养，形成多细胞团，植板率达12.5％。该研究为创造龙眼或荔枝的新种质、新品种或新型的水果提供了技术平台。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

第一章引言

1 问题的提出

2植物体细胞胚胎发生的研究进展

2.1植物体胚发生的途径与细胞学形态研究

2.2植物体胚发生过程中的生理生化变化的研究

2.3植物体胚发生及成熟的影响因素

3植物原生质体培养与融合研究进展

3.1植物原生质体培养研究进展

3.2植物原生质体融合研究进展

4荔枝、龙眼生物技术研究进展

4.1荔枝生物技术研究进展

4.2龙眼生物技术研究进展

4.3荔枝、龙眼生物技术中存在的问题

5本研究的主要内容及意义

第二章荔枝TPEC高频率体胚发生系统优化

第一节荔枝TPEC的继代保持与体胚发生的同步化调控

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节荔枝TPEC高频率体胚发生体系的建立

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节荔枝TPEC体胚成熟培养及植株再生

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三章荔枝TPEC继代、体胚发生及成熟过程中的生理生化机制研充

第-节荔枝TPEC继代、体胚发生和成熟过程中相关酶活性变化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节荔枝TPEC继代、体胚发生及成熟过程中相关同工酶分析

1材料与方法

2结果与分析

3.讨论

第三节荔枝TPEC体胚发生及成熟过程中总糖含量的变化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四节荔枝TPEC体胚发生及成熟过程中淀粉含量的变化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四章荔枝TPEC体胚的显微与超微结构观察

第一节荔枝TPEC体胚的细胞组织学观察

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节荔枝TPEC体细胞胚胎的超微结构观察

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第五章荔枝与龙眼原生质体电融合及初步培养

第一节荔枝TPEC原生质体分离条件的优化

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第二节荔枝、龙眼原生质体电融合适宜条件的研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节荔枝与龙眼电融合产物的初步培养

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第六章小结

1 荔枝TPEC高频率体胚发生体系的建立

2荔枝TPEC体胚发生机理的研究

3荔枝与龙眼原生质体融合及其产物初步培养

参考文献

图版说明

图版1

图版2

在学期间参加学术会议及发表相关论文

致谢