膀胱癌中DNA聚合酶Polι转录调控机制及其作用初步研究

摘要

膀胱上皮细胞癌是世界上发病最高的肿瘤之一，其在发达国家泌尿系统恶性肿瘤中发生率仅次于前列腺癌，在我国则居于泌尿系统肿瘤的首位。大量研究显示，具有高复发和高异质性的膀胱上皮细胞癌，在遗传性和表观遗传性方面存在众多异常。这对膀胱癌的早期防治和预后带来众多困扰。新近发现的DNA聚合酶iota(DNApolymeraseiota,Poli)是Y家族DNA聚合酶的成员，是细胞内维持基因组稳定性的跨损伤修复途径(translesionsynthesis，TLS)中的一员。Poli蛋白缺乏3'核酸外切酶活性，极易导致碱基错配。但高错配倾向的Poli表达可能受到严格调控，故在细胞内一般不发挥作用。一旦Poli表达异常，将可能主动参与DNA复制过程，导致基因突变进而产生肿瘤。前期研究发现，乳腺癌细胞中Poli高表达，且导致碱基突变率升高。另外在脑胶质瘤、食管癌、胃癌和前列腺癌等肿瘤组织中，也发现了Poli表达异常。这提示Poli的高致突变性在膀胱上皮细胞癌发生发展中可能也起到重要作用。了解Poli的表达调控及其功能，将增强对膀胱癌发生发展机制的理解，为寻找膀胱癌早期有效的防治靶标提供新思路。然而，目前对Poli的表达调控机制了解甚少，而且Poli在肿瘤发生发展中的分子功能仍扑朔迷离。
　　本课题对人POLI基因在膀胱癌细胞中表达调控机制进行了研究，并探讨了异常表达的Poli在膀胱上皮细胞癌中的致突变作用及临床意义。本研究工作主要有以下几个方面的内容:
　　1.首次鉴定转录因子c-Jun调控人POLI基因核心启动子
　　(1)人POLI基因启动子的生物信息学分析及鉴定
　　通过生物信息学软件对人POLI基因5'侧翼区约3000bp的序列进行分析，获得潜在的启动子区域和转录因子结合位点。成功构建含不同长度POLI基因5'侧翼序列的荧光素酶报告基因质粒并检测其活性，证实了人POLI核心启动子区域为-275/+63。生物信息学预测显示该区域存在潜在的AP-1家族转录因子结合位点。
　　(2)c-Jun蛋白上调人POLI基因启动子活性
　　通过人POLI基因启动子质粒与c-Jun真核表达质粒共转染，证实c-Jun蛋白可增强POLI启动子活性;而成功构建的c-Jun结合位点突变质粒的启动子活性较野生型质粒下降显著。
　　(3)体外、内实验鉴定c-Jun蛋白与POLI启动子的结合
　　获取HEK293细胞核蛋白，凝胶电泳迁移率变动实验(electrophoresismobilityshiftandsupershiftassay,EMSA)和染色质免疫共沉淀实验(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)证实c-Jun蛋白可与人POLI启动子区域结合。
　　2.证实JNK/c-Jun信号通路调控Poli蛋白表达
　　(1)DNA损伤剂紫外线(Ultravioletray,UV)诱导HEK293细胞后，人POLI基因启动子活性增强;WesternBlot检测Poli蛋白升高，并与c-Jun及其上游信号JNK的活化正相关。
　　(2)在HEK293细胞中，JNK特异性抑制剂(SP600125)和siRNA干扰c-Jun均抑制Poli蛋白表达，并减少了UV诱导的Poli蛋白。这证实JNK/c-Jun信号通路调控基础情况和UV介导的Poli蛋白表达。
　　(3)膀胱癌细胞株T24的Poli蛋白表达比RT4中高，并与c-Jun活性相关;另外SP600125可抑制膀胱癌细胞中Poli蛋白表达。这说明JNK/c-Jun信号通路调控Polι蛋白表达的机制为一普遍规律。
　　3.核内蛋白ATR和XPC通过JNK/c-Jun通路调控UV介导的Poli表达
　　(1)在HEK293细胞中，siRNA干扰DNA损伤应答蛋白ATR和XPC后，抑制了UV诱导的JNK/c-Jun活性并减少Poli蛋白表达。WesternBlot和Real-time进一步检测发现，ATR和XPC干扰不影响JNK/c-Jun的上游激活信号MKK4和MKK7，但增加了其抑制信号MKP-1的表达。这说明ATR和XPC通过JNK/c-Jun通路上调UV介导的Poli蛋白表达，提示核内DNA损伤应答途径与JNK/c-Jun信号转导之间存在交互作用。
　　(2)在膀胱癌细胞株T24中，WesternBlot检测发现:siRNA干扰核内蛋白ATR和XPC抑制了UV诱导的JNK/c-Jun活性并伴随着Poli蛋白减少。这说明在UV诱导的膀胱癌细胞中，核内蛋白ATR和XPC也通过激活JNK/c-Jun上调Poli蛋白表达。
　　4.膀胱上皮细胞癌临床样本中Poli、c-Jun异常表达与病理分级相关性分析
　　收集石蜡包埋的膀胱上皮细胞癌全切术后的临床组织标本，免疫组织化学法检测Poli和磷酸化的c-Jun蛋白水平，发现膀胱上皮细胞癌中Poli高表达并与磷酸化c-Jun水平一致。统计学分析证实高表达的Poli和活化的c-Jun与膀胱癌组织病理分级相关。这提示c-Jun调控的Poli表达升高在膀胱上皮细胞癌发生发展中发挥重要作用。
　　5.膀胱癌细胞中JNK/c-Jun调控Poli的致突变作用
　　UV损伤pSupF质粒后转染入高表达Poli的膀胱癌细胞株T24中，获取细胞内质粒并电转入SY204菌后，计算菌落突变数量发现突变频率明显升高;当SP600125预处理T24降低Poli表达后，突变频率则显著下降。经测序比对绘制的突变频谱显示，这些突变位点与Poli蛋白的致突变特点一致。这充分说明JNK/c-Jun调控的Poli参与膀胱癌细胞的高突变并促肿瘤发生，对深入理解肿瘤高遗传不稳定性具有重要意义。
　　综上所述，本研究分析了人POLI基因5'侧翼非翻译区约3000bp序列，确定了启动子区域位于-275/+63，首次证实c-Jun可增强POLI基因启动子活性及蛋白表达，并在体外、内实验中明确c-Jun蛋白可与POLI基因启动子结合。进一步研究发现，JNK/c-Jun调控基础条件及UV介导的Poli蛋白表达;DNA损伤应答核内蛋白ATR和XPC，通过抑制MKP-1而不是激活MKK4/MKK7，调控JNK/c-Jun进而增加DNA损伤诱导的Poli表达，提示核内DNA损伤应答途径与JNK/c-Jun信号通路之间存在交互作用。本研究首次证实膀胱上皮细胞癌中Poli的表达增高与磷酸化c-Jun一致，并与临床样本的病理分级正相关，明确了膀胱癌细胞中JNK/c-Jun调控的Poli表达增高在DNA损伤修复中发挥了致突变作用，说明JNK/c-Jun调控的Poli可能扮演着诱变基因的作用。本课题为阐明Poli的转录调控机制及其对膀胱上皮细胞癌发生发展的重要作用提供了线索，为寻找新的抗癌策略奠定了基础。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 转录因子c-Jun调控人POLI基因表达

2．1 人POLI基因启动子生物信息学分析及鉴定

2．2 c-Jun蛋白调节人POLI基因启动子活性

2．3 体外、内实验鉴定c-Jun蛋白与人POLI启动子结合

2．4 JNK/c-Jun信号转导调控Polι蛋白表达机制研究

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 膀胱癌中JNK/c-Jun调控Polι表达机制及其促肿瘤发生的研究

3．1 膀胱癌细胞中JNK/c-Jun调控Polι蛋白表达机制研究

3．2 膀胱癌临床样本Polι、c-Jun异常表达与病理分级相关性分析

3．3 膀胱癌细胞中JNK/c-Jun调控Polι的致突变作用

3．4 讨论

3．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述一 哺乳细胞中TLS聚合酶Y家族与肿瘤的关系

文献综述二 DNA聚合酶Polι的结构和功能研究进展

附录

攻读博士学位期间发表的论文

致谢