根皮苷对高血脂仓鼠抗动脉粥样硬化机制的研究

摘要

根皮苷，一种天然多酚类物质，用于病理学研究已有一百多年。实验以高脂高胆固醇饲喂仓鼠构建高胆固醇血症及氧化应激损伤模型，研究根皮苷抗动脉粥样硬化作用机制。36只仓鼠随机分为对照组，0.3％、0.6％和0.9％根皮苷组，测定仓鼠血脂水平，血清及织组抗氧化酶活力水平，气相色谱法检测肝脏中胆固醇水平及粪便中固醇的排泄水平，荧光定量PCR(real time-PCR，RT-PCR)法检测肝脏及小肠中胆固醇代谢调控基因肝脏中抗氧化酶基因的表达水平，westernblot法检测肝脏中胆固醇调控和抗氧化相关蛋白的表达水平。
　　根皮苷可降低血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平，升高高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平;根皮苷可降低肝脏中胆固醇含量仓鼠，促进固醇经粪便排出，且粪便中中性固醇和酸性固醇排泄量随根皮苷剂量增加而增加。RT-PCR检测结果显示，根皮苷上调肝脏中低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)、肝X受体(liverX receptorα，LXRα)、胆固醇7α羟化酶(cholesterol7α hydroxy-lase，CYP7A1)基因的表达，下调3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutarylcoenzyme A reductase，HMGCR)基因的表达。Western blot结果显示，根皮苷抑制肝脏中HMGCR蛋白表达水平，升高CYP7A1和LXRα表达水平。小肠中基因表达水平检测结果显示，根皮苷抑制HMGCR、NPC1L1、乙酰辅酶A乙酰转移酶(cholesterolacyltransferase2，ACAT2)、微粒体甘油三酯转运蛋白(microsomal triglyceride transferprotein，MTP) mRNA表达，升高ABCG5/8基因的表达水平。
　　抗氧化酶活力测定结果显示，给予根皮苷后血清、心脏、肾脏及肝脏中SOD、GSH-Px、CAT酶活力均有升高，氧化产物MDA含量显著降低。RT-PCR结果显示，根皮苷升高仓鼠肝脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，CuZn-SOD、Mn-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、血红素加氧酶1(heme oxygenase1，HO-1)、核因子E2相关因子2(nuclear factorE2-related factor2，Nrf2) mRNA的表达。Westernblot检测结果显示，根皮苷可升高Mn-SOD、HO-1和CAT蛋白质表达水平。
　　因此，根皮苷可通过调控胆固醇代谢相关酶和载体抑制胆固醇内源合成和促进胆固醇排泄降胆固醇，通过激活抗氧化基因Nrf2表达，并上调抗氧化基因SOD、GSH-Px、CAT、HO-1的转录和翻译抗氧化，从而保护高脂高胆固醇膳食仓鼠动脉粥样硬化的发生和发展。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 根皮苷的研究概况

1．1．1 根皮苷的发现及认识

1．1．2 根皮苷的来源

1．1．3 根皮苷的生理功能

1．2 心血管病

1．2．1 心血管病现状

1．2．2 血脂异常与心血管病

1．2．3 高血脂症

1．3 氧化应激

1．3．1 导致氧化应激的因素

1．3．2 氧化应激导致疾病

1．4 实验动物模型的选择

1．5 本课题的立题依据、研究内容及研究意义

1．5．1 国内外研究现状‘

1．5．2 课题研究意义及内容

2 材料与方法

2．1 实验材料与设备

2．1．1 原料

2．1．2 实验仪器与设备

2．2 主要实验试剂及试剂盒

2．3 实验方法

2．3．1 动物实验

2．3．2 血脂测定方法

2．3．3 肝脏胆固醇的测定

2．3．4 粪便中中性、酸性固醇的测定

2．3．5 血清及组织中抗氧化酶活力测定和氧化产物MDA的测定

2．3．6 RNA提取及cDNA合成方法

2．3．7 实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测基因表达水平方法

2．3．8 Western blot法检测相关蛋白质表达水平

2．4 统计分析

3 结果与讨论

3．1 根皮苷对高血脂症仓鼠的影响

3．1．1 根皮苷对仓鼠体重、进食量及脏器重量的变化

3．1．2 根皮苷对仓鼠血清血脂水平的影响

3．1．3 根皮苷对仓鼠肝脏胆固醇含量的影响

3．1．4 根皮苷对仓鼠粪便中中性及酸性固醇排出水平的影响

3．2 分子水平检测胆固醇代谢相关基因的表达水平

3．2．1 RNA纯度及完整性鉴定

3．2．2 RT-PCR扩增产物鉴定结果

3．2．3 RT-PCR是否特异性扩增鉴定结果

3．2．4 根皮苷对肝中HMG-CoA-R、LDL-R、SREBP-2、LXRα、CYP7A1、PPARα mRNA和蛋白质表达的影响

3．2．5 根皮苷对小肠中HMG-CoA还原酶、NPC1L1、ABCG5／8、ACAT2、MTP mRNA表达的影响

3．3 根皮苷对仓鼠抗氧化活性测定

3．3．1 根皮苷对血清、心脏、肾脏中SOD、GSH-Px、CAT酶活力及MDA含量的影响

3．3．2 根皮苷对肝脏中抗氧化酶活性及抗氧化相关基因表达的影响

3．3．3 根皮苷对肝脏中抗氧化调控基因Nrf2、HO-1、CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px蛋白质表达的影响

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士期间发表论文情况

致谢