尼可霉素生物合成基因簇的改造及其异源表达

摘要

尼可霉素(Nikkomycin)属于核苷肽类抗生素，由核苷丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺类似，和肽基两部分通过肽键连接而成。尼可霉素在结构上与几是几丁质合成酶的强竞争性抑制剂，可有效地抑制真菌细胞壁的合成，而导致其死亡，是一种具有应用前景的新型农用抗生素。
　　本文以含有完整尼可霉素生物合成基因簇的pNIK为出发质粒，通过PCR-targeting方法，将基因簇中sanG和sanF的启动子替换为组成型强启动子hrdB，目的是构建重组质粒pNIKm;通过链霉菌-大肠杆菌间接合转移的方法将pNIK和pNIKm分别导入天蓝色链霉菌M1146（Streptomyces coelicolor M1146）中;并通过RT-PCR的方法检测基因簇的表达情况;最后通过抗菌活性实验和产物的分离鉴定，观察尼可霉素的抗菌活性及产生情况。
　　本论文的主要研究成果如下:
　　(1)成功地构建了重组载体pNIKm，并使尼可霉素基因簇在异源宿主天蓝色链霉菌M1146中得到了成功的表达，得到了两个异源表达菌株M1146-NIK和M1146-NIKm;
　　(2)M1146-NIK和M1146-NIKm均对长柄链格孢有明显的抗菌活性;
　　(3)M1146-NIK和M1146-NIKm均能产生少量的尼可霉素X和Z，以及假尼可霉素Z;
　　(4)M1146-NIK和M1146-NIKm还产生了大量的中间体，M1146-NIK大量积累了核苷，而M1146-NIKm大量积累了尿苷、核糖基-4-甲酰-4-咪唑-2-酮和吡啶同型苏氨酸。
　　将尼可霉素生物合成基因簇导入异源宿主并成功表达，分离鉴定了尼可霉素的产物及其生物合成中间体，为尼可霉素核苷和肽基缩合的酶学机制的研究以及尼可霉素与其它核苷肽类抗生素的组合生物合成的研究提供理论依据和指导。

目录

声明

摘要

Abbreviations

Gene Symbol

Amino Acid Abbreviation

1 前言

1．1 链霉菌概述

1．1．1 链霉菌的基本特征

1．1．2 链霉菌的基因组特征

1．2 核苷肽类抗生素概述

1．3 尼可霉素的生物合成及其分子调控

1．3．1 尼可霉素的生物合成

1．3．2 尼可霉素的生物合成调控

1．3．3 尼可霉素与其他核苷肽类抗生素的组合生物合成研究

1．4 异源表达

1．5 本论文的研究内容及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株、质粒及引物

2．1．2 酶及常用试剂

2．1．3 主要仪器和设备

2．1．4 培养基

2．1．5 缓冲液

2．1．6 各种抗生素的贮存浓度和使用浓度

2．2 方法

2．2．1 大肠杆菌及链霉菌质粒的小量提取

2．2．2 链霉菌总DNA的少量制备及PCR扩增条件

2．2．3 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．4 PCR targeting

2．2．5 链霉菌大肠杆菌之间的接合转移

2．2．6 链霉菌RNA的提取及RT-PCR

2．2．7 发酵产物的生物活性检测

2．2．8 发酵产物的HPLC分析

2．2．9 发酵产物的分离、纯化

3 结果与讨论

3．1 重组质粒pNIKm的构建及酶切验证

3．1．1 重组质粒pBS-HIhF的构建

3．1．2 重组质粒pSET152-hGX的构建

3．1．3 重组质粒pNIKm的构建及酶切验证

3．2 异源表达菌株M1146-NIK和M1146-NIKm的构建及PCR验证

3．3 尼可霉素的异源表达对基因簇内关键基因的转录影响

3．3．1 RNA质量检测

3．3．2 基因簇内关键基因的转录情况

3．4 发酵产物的抗真菌活性检测

3．5 发酵产物的巴比妥酸显色反应的检测

3．6 发酵产物的分离和纯化

3．7 发酵产物的鉴定

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士期间发表论文情况

致谢