中国虎纹蛙、花臭蛙、大绿臭蛙、弹琴蛙线粒体基因组序列的测定与无尾目的系统发生分析

摘要

动物线粒体基因组作为独立于细胞核基因之外的DNA,具有分子量小、母性遗传等特点,一般含有37个基因,因其具有独特的遗传方式通常可用于分子系统学和分子进化等方面的研究。线粒体基因组作为研究基因组结构与功能、生物进化的分子手段,对探讨无尾目的系统发生具有重要的理论意义和实践价值。
　　 本论文采用常规PCR和长PCR(LA-PCR)技术对蛙总科四种蛙类的线粒体基因组全序列进行测定,并结合NCBI数据库中的无尾目线粒体基因组全序列,探讨了蛙科和叉舌蛙科之间的系统发生关系。获得以下结果:
　　 1.所测得的四种蛙总科线粒体基因组,分别为中国虎纹蛙(Hoplobatrachusrugulosus)(16,903 bp)、弹琴蛙(Babina adenopleura)(18,982 bp)、花臭蛙(Odorrana schmackeri)(16,783 bp控制区未测全)、大绿臭蛙(Odorrana livida)(16,059 bp控制区未测全)。中国虎纹蛙线粒体的基因组成、基因顺序和转录方向与虎纹蛙(H.tigerinus)线粒体基因组一致,包含13个蛋白编码基因(PCG),22个tRNA基因(tRNA-Leu缺失,额外多了个tRNA-Met),2个核糖体基因和1个D-loop；弹琴蛙(B.adenopleura)线粒体的基因组成、基因顺序和转录方向与蛙科其他物种线粒体基因组一致,包含13个蛋白编码基因(PCG),22个tRNA基因,2个核糖体基因和1个D-loop；大绿臭蛙(O.livida)线粒体的基因组成、基因顺序和转录方向与石川臭蛙(O.ishikawae)线粒体基因组一致,包含13个蛋白编码基因,22个tRNA基因(tRNA—His移至D-loop的5'端),2个核糖体基因和1个D-loop；花臭蛙(O.schmackeri)线粒体的基因组成除丢失tRNA-His外其余各基因顺序和转录方向均与石川臭蛙(O.ishikawae)线粒体基因组一致,包含13个蛋白编码基因(PCG),21个tRNA基因(tRNA-His缺失),2个核糖体基因和一个D-loop。所测的四个物种中,中国虎纹蛙存在ND5基因的重排,但在弹琴蛙、花臭蛙和大绿臭蛙中均未发现ND5基因的重排。
　　 2.通过对无尾目各物种线粒体基因组A+T总含量的比较,发现叉舌蛙科的A+T含量跨度从53.1-62.3％,远远大于蛙科的A+T含量跨度(56.5-58.9％),其中中国虎纹蛙(H.rugulosus)的A+T总含量是无尾目已知物种中最低,并且发现其控制区A+T总含量也是已知无尾目中最低。所有无尾目物种的GC Skew均为负值说明G　　 3.无尾目物种的蛋白编码基因中使用最多的起始密码子是ATA,其次是ATG；使用最多的终止密码子是TAA。
　　 4.在四种所测定的无尾目物种的tRNA二级结构中,一般都存在碱基错配现象,其中绝大部分碱基错配为U·G错配。
　　 5.在所有新蛙亚目物种中tRNA-Leu,tRNA-Pro,tRNA-Thr和tRNA-Phe均从原来的位置发生转移,并在12S rRNA基因的上游形成“LTPF基因簇”(或修饰的LTPF基因簇)。在我们所测得的四种蛙总科物种中,叉舌蛙科的中国虎纹蛙(H.rugulosus)形成“TPF基因簇”,而蛙科的大绿臭蛙、花臭蛙、弹琴蛙均形成“LTPF基因簇”。分析叉舌蛙科已知线粒体基因全序列,发现“LTPF基因簇”重排的现象非常普遍,有的甚至出现tRNA-Leu或tRNA-Thr基因的丢失,但在蛙科已知物种中均出现“LTPF基因簇”,这与典型的新蛙亚目的基因特点一致。
　　 6.中国虎纹蛙(叉舌蛙科)线粒体基因组的各个基因间隔区中最长的位于tRNA-Ser-UCN与ND6基因之间,蛙科线粒体线粒体基因组的间隔区主要位于ND5与ND6基因之间,弹琴蛙为461 bp,花臭蛙为388 bp,大绿臭蛙为52 bp。
　　 7.已测得的叉舌蛙科虎纹蛙属的中国虎纹蛙具有两个串联重复的tRNA-Met基因,与已知叉舌蛙科物种的线粒体基因组序列一致,进一步验证了两个串联重复tRNA-Met基因可以作为叉舌蛙科的特征；中国虎纹蛙出现tRNA-Leu基因丢失的现象,该现象与虎纹蛙特征一致,提示tRNA-Leu基因的丢失或许可以作为虎纹蛙属的特征；大绿臭蛙tRNA-His基因发生重排,从tRNA-Ser和ND5基因之间移位至D-loop和tRNA-Leu基因之间,同时在花臭蛙的D-loop和tRNA-Leu基因之间找到类似tRNA—His的假基因,而凹耳蛙tRNA-His也发生重排,从tRNA-Ser和ND5基因之间移位至D-loop和tRNA-Leu基因之间,该重排现象暗示凹耳蛙与臭蛙属具有共同的起源。
　　 8.本研究基于线粒体基因组全序列的12个蛋白编码基因对无尾目39个物种构建系统发生树(BI、ML、MP),系统发生树的结果强烈支持蛙科、叉舌蛙科的单系性；蛙科中的凹耳蛙与臭蛙属中的其他三个物种石川臭蛙、花臭蛙和大绿臭蛙聚成一支,凹耳蛙聚入臭蛙属,臭蛙属的单系性受到挑战。因凹耳蛙的分类地位本身存在较大的争议,本研究建议把凹耳蛙从湍蛙属中分出而归入臭蛙属。叉舌蛙科明显分成四支,即浮蛙族、叉舌蛙族、棘蛙族、大头蛙族；系统发生树强烈支持棘蛙族与大头蛙族形成姐妹群关系,浮蛙族位于叉舌蛙科的基部,证明了浮蛙族是叉舌蛙科原始的类群。