l-色氨酸生产菌构建及发酵条件优化

摘要

L-色氨酸是人和动物生命活动中必需的氨基酸之一，目前L-色氨酸已经广泛应用于医药、食品及饲料等方面，其中饲料方面的需求量最大。本文以代谢工程理论为指导，以L-色氨酸生产菌E.coli TRTH为出发菌株，针对不同代谢问题分别构建了不同基因缺失或过表达的L-色氨酸工程菌株。
　　为了减少三羧酸循环对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的消耗，使PEP更多的合成L-色氨酸，本文构建了基因ptsG（编码葡萄糖特异性转运蛋白EⅡ CBGlc，TCA循环消耗PEP的关键蛋白）缺失的L-色氨酸生产菌E.coli TRTHΔptsG。在此基础上过表达了编码大肠杆菌葡萄糖激酶的glk和编码运动发酵单胞菌葡萄糖转运蛋白的基因glf，得到TRTH(pSTV28-KTF)ΔptsG。5L发酵罐分批补料发酵实验结果显示，重组菌TRTH(pSTV28-KTF)ΔptsG和TRTH(pSTV28)ΔptsG的生物量(g DCW/L)和L-色氨酸产量分别达到16.24、4.58 g和10.25 g/L、3.1 g/L，较出发菌TRTH分别下降49.12％、85.84％和61.32 g/L和88.30％。以上结果表明:ptsG的缺失对菌体的生长代谢影响较大。虽然glk和glf的过表达一定程度上改善了菌体的糖转运，但仍然不能弥补ptsG缺失对菌体造成的影响。
　　为了进一步增加碳源流向L-色氨酸合成途径，构建了基因ppc（编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）缺失的L-色氨酸生产菌E.coli TRTHΔppc。摇瓶补料发酵结果显示:TRTHΔppc的生物量、L-色氨酸产量和乙酸积累量分别为1.38 g DCW/L，1.5g/L，和3.4 g/L，分别是出发菌的18.60％、28.30％和32.69％。数据显示，ppc的缺失对TRTH的生长和产酸能力有部分影响。向发酵培养基中补加琥珀酸后，菌体的生长和产酸能力并未较之前有好转，表明ppc的缺失并未影响TRTH的产琥珀酸能力。
　　为了强化乙醛酸循环，减少TCA循环的CO2损失，形成更经济的代谢方式，本文构建了基因iclR（编码乙醛酸操纵子阻遏蛋白）缺失的L-色氨酸生产菌E.coliTRTHΔiclR。摇瓶分批补料发酵结果显示:TRTHΔiclR的L-色氨酸产量、糖酸转化率分别达到6.52±0.46 g/L和13.17％，比原菌分别提高了21.32％和22.41％;乙酸累积量为6.82 g/L，比原菌降低了37.63％。30 L发酵罐分批补料发酵显示:TRTHΔiclR的L-色氨酸产量及糖酸转化率分别达到13.01±1.05 g/L和6.51％，比原菌下降了60.42％和68.31％;乙酸累积量为18.21 g/L，比原菌增加了33.42％;以上结果表明，发酵罐条件下，乙醛酸循环的增强导致重组菌株供能不足和乙酸的过多积累，最终使得生物量不足以及L-色氨酸产量下降。
　　以上改造菌株测试后，均有不同程度的能量供应不足，故为了增加胞内ATP水平，分别敲除了与ATP能量代谢相关的三个基因ysaA、ydaS和ybiX,相继构建了TRTHΔysaA、TRTHΔydaS和TRTHΔybiX和TRTHΔysaAΔydaS。摇瓶分批补料发酵实验结果显示:三株单敲除菌的生物量、L-色氨酸产量和糖酸转化率较出发菌均有不同程度的提高。而双敲除菌的以上指标略有下降。30 L发酵罐分批补料发酵实验结果显示:TRTHΔysaA、TRTHΔydaS、TRTHΔybiX和TRTHΔysaAΔydaS生物量和L-色氨酸产量叫出发菌均有下降。胞内ATP(mmol/L)浓度最高值均在细胞生长前期，在4h达到3.20、7.04、6.04和7.13，除TRTHΔysaA外，其他三株重组菌均与出发菌基本持平，但此后则胞内ATP浓度迅速下降，明显低于出发菌同时期水平。以上结果表明，强化能量供应还应更精细和系统的操作，否则效果不佳。
　　最后，采用单因素实验对30L发酵罐培养L-色氨酸生产菌E.coli TRTH的初始发酵培养基进行优化。得到最优培养基为:葡萄糖7.5 g/L，酵母粉1 g/L，棉籽精粉20 g/L，柠檬酸2g/L，(NH4)2SO41.6 g/L，K2HPO47.5 g/L，MgSO4.7H2O1.6 g/L,微量元素1 mL/L。此配方对菌体积累L-色氨酸具有明显的促进作用，使L-色氨酸产量有了较大提升，达到了40.52 g/L，比原配方(32.5 g/L)提高了24.62％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 引论

1．2 L-色氨酸的理化性质

1．3 L-色氨酸的应用

1．3．1 L-色氨酸在食品领域的应用

1．3．2 L-色氨酸在医药领域的应用

1．3．3 L-色氨酸在饲料领域的应用

1．3．4 L-色氨酸在农业及环境检测领域的应用

1．4 L-色氨酸生产的发展概况

1．5 L-色氨酸生产菌的构建

1．5．1 L-色氨酸合成途径的分析

1．5．2 Red重组系统

1．5．3 L-色氨酸工程菌的构建历程

1．5．4 L-色氨酸工程菌的构建策略

1．6 L-色氨酸的市场分析及工业生产概况

1．7 本课题研究内容

1．7．1 增加前体物的合成

1．7．2 强化支路代谢乙醛酸循环

1．7．3 强化能量货币-ATP的合成

1．7．4 优化初始发酵培养基

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌种

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要溶液

2．2 培养基

2．2．1 LB培养基

2．2．2 斜面培养基

2．2．3 摇瓶培养种子初始培养基

2．2．4 摇瓶培养发酵初始培养基

2．2．5 5 L发酵罐培养种子初始培养基

2．2．6 30 L发酵罐分批发酵初始培养基

2．2．7 其他培养基

2．3 实验方法

2．3．1 分子实验方法

2．3．2 发酵培养方法

2．3．3 发酵液相关测定方法

3 结果与讨论

3．1 增加L-色氨酸前体物对L-色氨酸发酵的影响

3．1．1 E．coli TRTHΔptsG菌株的构建

3．1．2 E．coli TRTH(pSTV28-KTF)ΔptsG菌株的构建

3．1．3 TRTH(pSTV28-KTF)ΔptsG，TRTH(pSTV28)ΔptsG和TRTH的发酵对比实验

3．1．4 E．coli TRTHΔppc菌株的构建

3．1．5 TRTHΔppc菌株的摇瓶分批补料发酵结果

3．2 增加乙醛酸循环支路代谢对L-色氨酸的影响

3．2．1 E．coli TRTHΔiclR菌株的构建

3．2．2 iclR基因缺失对L-色氨酸发酵的影响

3．2．3 讨论

3．3 增加能量代谢对L-色氨酸发酵的影响

3．3．1 TRTHΔysaA、TRTHΔydaS和TRTHΔybiX菌株的构建

3．3．2 TRTHΔysaAΔydaS菌株的构建

3．3．3 菌株的发酵验证

3．4 优化发酵培养基对L-色氨酸发酵的影响

4 结论

5 展望

参考文献

7 研究生期间所发表论文情况

致谢