不同发育时期双酚A暴露对子代成年小鼠焦虑和抑郁的影响及其神经机制

摘要

双酚A(bisphenolA，BPA)是一种典型的具有弱雌激素活性的环境内分泌干扰物，对脑和行为发育的影响已引起关注。大量研究表明中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)的发育对BPA十分敏感。本实验室前期研究发现，围生期低剂量BPA虽然不影响子代生殖系统的生长和发育，却影响子代小鼠幼年期和青年期的多种行为的发育及其性别分化，其中焦虑行为对BPA特别敏感。雌激素影响脑发育及其性别分化的关键时期为胚胎晚期至出生早期这一时期，而其中哪一时期BPA暴露干扰雌激素对脑发育的调节作用最为显著还不清楚？许多研究证明，下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴与雌激素调节焦虑和抑郁作用密切相关，边缘系统特别是海马和杏仁核一直以来被认为是参与调节下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的主要组成部分，也是雌激素影响焦虑和抑郁的主要靶位。BPA作为一种具有弱雌激素活性的内分泌干扰物可通过模拟或干扰体内雌激素的合成、分泌来影响体内雌激素的含量，从而进一步影响焦虑和抑郁行为的研究已有很多，但具体的分子机制尚不清楚。许多研究表明谷氨酸能相关的受体N-甲基-D-天冬氨酸(N-methy-D-aspartate，NMDA)受体和A-氨基-3羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionateacid,AMPA)受体、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)能递质系统与焦虑和抑郁行为密切相关。同时，本实验室前期发现，围生期母体双酚A暴露下调NMDA受体表达和亚基组成。因此，本研究通过妊娠期和哺乳期母体BPA暴露探讨发育不同阶段BPA对仔鼠成年早期焦虑和抑郁行为的影响，进一步分析脑内海马和杏仁核NMDA受体、AMPA受体和GABA受体表达的变化与仔鼠焦虑和抑郁行为的关系，初步探索发育期BPA暴露对子代成年早期小鼠的焦虑和抑郁行为影响的分子机制。
　　 方法:清洁级雌性(25-30g)、雄性(30-35g)ICR小鼠，饲养环境为12h昼夜交替，食物和水自由摄取。适应一周后，每日20:00按雌∶雄为1∶1合笼交配，次日清晨检查雌鼠阴道和阴道涂片，查到阴栓或精子细胞定为妊娠第0天(gestationday0，GD0)。检查出妊娠后，母鼠单独喂养。母鼠分为妊娠期和哺乳期BPA暴露的两个时期组。妊娠期组在母鼠GD7-20、哺乳期组母鼠在仔鼠出生后第0-14天（postnatalday,PND0-14）灌胃染毒。以旷场、明暗箱、镜子迷宫、高架十字迷宫等多种模型检测生后PND56仔鼠的焦虑行为，以强迫游泳模型检测其抑郁行为。选未进行行为测试的PND56小鼠，按要求取海马和杏仁核样品，Westernblot检测脑内海马和杏仁核区域NMDA受体NR1亚基、AMPA受体GluR1亚基和GABA受体GABAAβ1-3亚基的表达。同时称量体重和生殖器官重量，放射免疫法检测雌性小鼠血清中雌激素的含量以及雄性小鼠血清中睾酮的含量。
　　 用MetaMorph软件测定蛋白条带光密度值，采用SPSS15.0统计软件进行数据分析，生殖器官系数和血清激素水平采用双因素方差分析:暴露时期×剂量;体重、旷场行为、明暗箱、镜子迷宫、高架十字迷宫和强迫游泳数据采用三因素方差分析:母体暴露时期×性别×剂量，进行t检验，p＜0.05作为具有统计学差异显著性。
　　 结果:1、妊娠期BPA暴露显著降低雌性仔鼠的体重(p＜0.01);哺乳期BPA暴露显著增加雌性仔鼠的体重(p＜0.05);妊娠期、哺乳期均增加雄鼠的体重(p＜0.05，p＜0.01);妊娠期或哺乳期BPA暴露对子代成年早期小鼠的生殖器官/体重比均未产生显著性影响。
　　 2、妊娠期BPA暴露的雌鼠在所有4种模型中均表现出促焦虑作用，增加其在旷场模型中的理毛频率(p＜0.01)、减少在明箱中的停留时间(p＜0.05)以及穿梭次数(p＜0.05)、在镜区的停留时间(p＜0.05)、在高架十字迷宫中进入开放臂的时间和次数(p＜0.01)以及在中央区探头的次数(p＜0.05)。哺乳期BPA暴露的雌鼠、妊娠期或哺乳期BPA暴露的雄鼠仅在2种模型中表现出促焦虑作用，哺乳期BPA暴露减少雌鼠在明箱的停留时间(p＜0.05)、在高架十字迷宫中进入开放臂的时间和次数(p＜0.01，p＜0.01);妊娠期BPA暴露减少雄鼠在明箱中的停留时间(p＜0.05)和在高架十字迷宫中进入开放臂的次数(p＜0.01);哺乳期BPA暴露增加雄鼠在镜子迷宫中的穿梭次数(p＜0.05)，减少其在高架十字迷宫中进入开放臂的次数(p＜0.01)。以上结果表明，妊娠期或哺乳期BPA暴露对成年雌雄仔鼠均有不同程度的促焦虑作用，其中妊娠期暴露对雌鼠的作用最显著。
　　 3、妊娠期BPA暴露显著增加雌雄仔鼠在强迫游泳模型中静止不动的时间(p＜0.01，p＜0.01)，表明加重雌雄仔鼠的抑郁行为，而哺乳期仅高剂量BPA(4mg/kg)加重仔鼠的抑郁行为(p＜0.01)，表明妊娠期或哺乳期BPA暴露对成年雌雄仔鼠均有不同程度的促抑郁作用。
　　 4、进一步Westernblot分析显示，妊娠期BPA暴露下调雌性仔鼠海马和杏仁核GluR1亚基和GABAAβ1-3亚基的表达(p＜0.05，p＜0.01)，下调海马NR1亚基(0.4mg/kg，p＜0.05)却上调杏仁核NR1亚基的表达(4mg/kg，p＜0.05);哺乳期BPA暴露下调雌性仔鼠海马和杏仁核GluR1亚基和GABAAβ1-3亚基的表达（均为p＜0.05）以及海马NR1亚基的表达(p＜0.05，p＜0.01)，但对杏仁核NR1没有影响。妊娠期BPA(4mg/kg)暴露下调雄性海马GluR1亚基和GABAAβ1-3亚基(p＜0.01，p＜0.01)，而低剂量BPA下调雄性杏仁核GluR1亚基和GABAAβ1-3亚基的表达(p＜0.01，p＜0.01);哺乳期BPA暴露下调雄性海马GluR1亚基和GABAAβ1-3亚基的表达(p＜0.01，p＜0.05)，低剂量BPA下调雄性杏仁核GluR1亚基的表达(p＜0.01）。
　　 结论:以上结果提示，妊娠期或哺乳期BPA暴露对成年雌雄仔鼠均有不同程度的促焦虑和抑郁作用，其中妊娠期暴露对雌鼠的作用最显著，海马和杏仁核AMPA受体和GABA受体活动的减弱可能与围生期BPA暴露加重仔鼠成年后的焦虑和抑郁行为有关。

目录

摘要

符号说明

第一章 绪论

1 BPA对人类的影响及概述

2 雌激素对焦虑和抑郁行为的影响

3 BPA对焦虑和抑郁行为的影响

4 NMDA受体、AMPA受体和GABA受体与焦虑和抑郁行为的联系

5 本研究的目的及意义

第二章 BPA暴露对子代成年早期小鼠生长发育的影响

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三章 BPA暴露对子代成年小鼠焦虑和抑郁行为的影响

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第四章 BPA暴露对子代成年早期小鼠NMDA受体、AMPA受体和GABA受体表达的作用

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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