水稻PCD及抗病相关基因SPL5的功能分析

摘要

植物在长期的进化过程中形成了一套复杂且有效的作用机制来适应环境和抵御病原菌的侵染，植物与病原菌的相互作用会引发超敏反应（hypersensitiveresponse，HR），HR是指植物在受到病原菌侵染后，在侵染部位诱发细胞死亡，从而有效阻止病原菌增殖的植物特异性防卫反应，属于细胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)。一些植物在发生突变以后能够在没有逆境、损伤或病原物侵染的情况下自发形成细胞死亡，这类突变体叫做类病变突变体（lesionmimicmutant，LMM）。如今，LMM已经成为我们研究植物PCD及抗病机制的有力工具。水稻类病变突变体spl5能够激活自身的免疫防御系统，有效地抵御多个稻瘟病及白叶桔病菌的入侵。本课题组已在前期的研究中成功的克隆了水稻SPL5基因，并初步判断该基因可能是一个PCD及抗病信号途径中的负调控因子，但究其是如何参与并调控这些途径的还尚不清楚。本次研究我们首先对SPL5基因在水稻不同组织中的表达情况进行了分析，发现其在叶、茎、老穗、内稃、外稃中表达量较高，在鞘、根、幼穗、花中的表达量较低，并通过GUS组织化学染色加以验证。另外，我们利用绿色荧光蛋白(GFP)，将其与SPL5基因融合表达，通过SPL5基因的亚细胞定位发现其在细胞核、细胞质中表达，表明SPL5基因在这些部位行使了自身的生物学功能。利用基因芯片技术对spl5突变体与野生型对照进行基因表达谱分析，共筛选得到199个差异表达基因，涉及防御相关、氧化还原、植物激素、氨基酸代谢、信号转导、光合作用等多个生物学途径。进一步研究表明水稻spl5突变体中的色氨酸代谢途径被激活，致使该途径中的相关基因，如:WRKY14、邻氨基苯甲酸合成酶、吲哚-3-磷酸甘油合成酶、色氨酸合成酶、色氨酸脱羧酶的表达量明显上升，最终导致代谢产物5-羟色胺的含量大幅增加。经我们分析认为5-羟色胺的积累可能激活了植物的免疫防御系统，并引发了细胞死亡。生物信息学分析表明SPL5基因可能编码剪接因子3b亚基3(splicingfactor3bsubunit3，SF3b3)，参与pre-mRNA的剪接加工过程。利用转录组测序技术对spl5突变体与野生型对照进行可变剪接分析，筛选得到36个spl5突变体独有的可变剪接差异基因，发现其中有较多基因涉及叶绿体和光合作用，这些基因的剪接异常可能引起spl5突变体中的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)代谢失衡，诱发HR。本研究从不同角度分析了SPL5基因的功能，为更好的阐明SPL5基因介导的植物PCD及抗病信号分子机制打下了坚实的基础。

目录

论文说明

摘要

缩略表

第一章 文献综述

1 细胞程序性死亡(PCD)概述

2 植物类病变突变体(LMM)

3 LMM的一般特征

4 LMM在PCD研究中的作用

4．1 鞘脂类LMM在PCD中的作用

4．2 Ca2+相关LMM与PCD的联系

4．3 叶绿体相关LMM在PCD中的作用

5 植物PCD及抗病信号途径中的信号分子

5．1 活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)

5．2 植物激素

6 水稻LMM的研究进展

7 RNA剪接及可变剪接

7．1 pre-mRNA剪接的基本过程

7．2 pre-mRNA剪接过程中的剪接因子

7．3 可变剪接及其生物学功能

8 本研究的内容和意义

第二章 水稻SPL5基因的组织表达分析及亚细胞定位

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 质粒和菌株

1．3 水稻SPL5基因的组织表达分析

1．4 水稻SPL5基因的GUS组织化学染色

1．5 水稻SPL5基因的亚细胞定位

2 结果分析

2．1 水稻SPL5基因在不同组织中的RT-PCR及qPCR表达分析

2．2 水稻SPL5基因的GUS组织化学染色

2．3 水稻SPL5基因的亚细胞定位

3 讨论

第三章 SPL5调控的PCD及抗病信号途径分析

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 基因芯片的制作

1．3 差异基因的筛选及其生物信息学分析

1．4 差异基因的qPCR表达分析

1．5 高效液相色谱检测

2 结果分析

2．1 差异基因的筛选及其功能分类

2．2 差异基因的聚类及pathway分析

2．3 差异基因的qPCR表达分析

2．4 高效液相色谱检测

3 讨论

第四章 SPL5对水稻基因的可变剪接调控分析

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 转录组测序

1．3 可变剪接差异基因的筛选及其生物信息学分析

2 结果分析

2．1 可变剪接差异基因的筛选

2．2 可变剪接差异基因的功能分类

3 讨论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文目录

声明