水稻黑条矮缩病毒诱导形成瘤状结构的组织学特征及基因表达差异分析

摘要

水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）第2亚组成员，其基因组由10条双链RNA组成(S1～ S10)，分别编码13个病毒蛋白。RBSDV侵染水稻、玉米分别引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病，主要在我国华东、华北和西北地区的粮食作物上流行成灾，给粮食生产造成严重影响。RBSDV以灰飞虱（Laodelphax striatellus）作为主要传播媒介，在灰飞虱取食过程中侵染植物的维管组织，引起寄主植物矮化、瘤状结构发生等明显的病症。植物维管组织是植物运输有机物质的重要通道，人们对RBSDV如何在植物维管组织内增殖、扩散以及诱导叶脉形成瘤状突起的机制尚不了解。
　　本研究以感染RBSDV的玉米植株为材料，用酸性品红等化学染料染色观察，结合免疫胶体金标记、免疫荧光标记和蛋白组学分析等方法分析瘤状结构组织的病理学特点，研究RBSDV的侵染与玉米植株瘤状突起发生之间的联系。
　　瘤状结构的显微解剖观察显示，RBSDV诱导叶脉形成的瘤状结构存在于维管组织的韧皮部附近，与健康叶脉的组织结构差异明显，主要表现为韧皮部细胞大量增生，细胞形态不规则，排序结构无序。用酸性品红等化学染料对瘤状组织的横切和纵切结构进行染色，发现在正常韧皮部组织和增生组织间存在着增厚的细胞隔层，靠近隔层的早期增生细胞与成熟筛管分子形态相似，都没有细胞核。正常韧皮部中，无细胞核的筛管分子(SE)和有细胞核的伴胞(CC)排列整齐有序，具有固定的细胞形态，而增生区的大多数细胞含有较大的细胞核和丰富的细胞质，分裂活动旺盛，具有无限分裂增生的特性。胼胝质专一性染料染色结果和胼胝质免疫胶体金标记结果显示，增生细胞和韧皮部细胞的细胞壁上有少量胼胝质产生。根据以上结果，瘤状结构的形成主要由韧皮部细胞的大量增生引起，增生细胞的生长模式跟正常韧皮部细胞存在差异。
　　在研究RBSDV和瘤状结构形成之间的关系中，利用Western blot技术检测病毒在玉米植株内的分布情况，结果显示RBSDV存在于玉米的根、茎、叶中，表明RBSDV能在玉米体内系统性侵染，而且根部的韧皮部也有多个增生细胞团出现。我们结合了冷冻切片技术和免疫荧光标记技术，对瘤状结构中的病毒蛋白进行免疫荧光标记。结果显示，瘤状叶脉的韧皮部细胞壁上发现有荧光素标记的病毒蛋白，在根部的韧皮部细胞和皮层细胞中也发现有病毒蛋白存在。玉米的叶脉内存在大、小维管束和横向维管束，韧皮部细胞增生现象只发生在大维管束内，荧光素标记的病毒蛋白发出的荧光在大、小维管束中均有发现，推测RBSDV粒子能够通过横向维管束进行横向运输。
　　植物病症的发生和形成受到许多基因的调控，为了筛选出RBSDV诱导玉米叶脉形成瘤状结构的相关基因，用蛋白质双向电泳、质谱技术和RT-PCR技术分析了瘤状叶脉形成前后表达发生变化的因子，筛选得到25个表达差异较大的蛋白因子，其中6个表达水平发生上调，19个发生下调。RT-PCR分析25个差异蛋白的基因在转录水平的变化，发现有3个基因上调，22个基因下调。综合分析25个差异蛋白在表达水平和转录水平的变化，16个基因的表达水平和转录水平变化一致，其余9个变化相反。结合序列鉴定和比对结果，其中有10个蛋白的功能未知，其余15个表达差异蛋白的功能与植物生长、发育、胁迫应答和免疫进程等紧密相关，可能在RBSDV诱导玉米叶脉形成瘤状结构的过程中发挥重要的作用。
　　综上所述，玉米叶脉表面的瘤状突起主要由韧皮部细胞大量增生所引起，RBSDV与叶脉上瘤状结构的形成紧密相关。本文的研究结果对瘤状结构的形成提供了重要的实验依据，进一步分析、验证表达差异蛋白在RBSDV致瘤过程中的作用，将有助于解析RBSDV诱导玉米叶脉形成瘤状结构的机制。

目录

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 呼肠孤病毒科的植物致瘤病毒

1．1．1 水稻病毒属

1．1．2 植物呼肠孤病毒属

1．1．3 斐济病毒属

1．2 RBSDV

1．2．1 基因组结构及其功能分析

1．2．2 传播介体和寄主范围

1．2．3 RBSDV危害和病症

1．3 植物瘤形成因素

1．3．1 致瘤细菌

1．3．2 致瘤病毒

1．3．3 致瘤真菌

1．3．4 致瘤线虫

1．3．5 致瘤昆虫

1．3．6 遗传因素

1．4 植物致瘤机制研究

1．4．1 细胞周期调控

1．4．2 分生组织调控

1．4．3 植物激素调控

1．5 研究目的与意义

第二章 瘤状结构的细胞病理学特点分析

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 仪器

2．1．3 试剂

2．2 方法

2．2．1 玉米病株及瘤状结构外部形态观察

2．2．2 瘤状结构内部形态观察

2．2．3 免疫胶体金标记技术

2．3 结果与分析

2．3．1 病株及瘤状结构外部形态

2．3．2 瘤状结构内部特征

2．4 讨论

第三章 瘤状结构与RBSDV相关性分析

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 仪器

3．1．3 实验试剂

3．2 方法

3．2．1 冷冻切片制作

3．2．2 免疫荧光标记

3．2．3 Western blot检测

3．3 结果与分析

3．3．1 病毒蛋白在玉米植株内分布

3．3．2 瘤状结构中病毒蛋白的免疫荧光标记

3．3．3 瘤状结构中病毒蛋白的免疫胶体金标记

3．4 讨论

第四章 诱导瘤状结构形成的相关基因筛选

4．1 材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 仪器

4．1．3 试剂

4．2 方法

4．2．1 表达差异蛋白分析

4．2．2 基因转录水平差异分析

4．3 结果与分析

4．3．1 表达差异蛋白分析

4．3．2 基因转录水平差异

4．4 讨论

第五章 全文小结及展望

5．1 全文小结

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间取得的研究成果

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