铜离子急性胁迫对虎纹蛙肝脏中三羧酸循环及自由基代谢的影响

摘要

本文研究了铜离子(Cu2+)对虎纹蛙的半致死浓度，在此基础上研究了6个Cu2+浓度（分别为（0.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/L）在5个暴露时间段(0、24、48、72和96h)对虎纹蛙（Hoplobatrachus chinensis）肝脏线粒体中三羧酸循环——异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，ICDHm)活性、α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase，α-KGDH)活性;线粒体呼吸链的自由基代谢，包括抗超氧阴离子（anti-·O2-）活性、过氧化氢(H2O2)含量、抑制羟自由基（inhabit-·OH）活性、一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合成酶(NOS)活性的影响，旨在探明Cu2+对线粒体TCA循环与自由基代谢的毒性作用，为探讨重金属污染导致两栖类种群下降的机制以及含铜废水排放标准的制定提供理论依据，同时也可为该物种的野外保护提供重要的数据支持。
　　结果显示:
　　(1)在Cu2+对虎纹蛙半致死浓度实验中，在浓度较低时虎纹蛙的死亡率较低，随着Cu2+浓度的增加和暴露时间的延长，虎纹蛙的死亡率呈现上升的趋势，在24h Cu2+浓度为8.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0和100.0 mg/L的溶液中虎纹蛙的死亡率为0，0，0，10.00％，46.67％，73.33％和76.67％;在48h Cu2+浓度为8.0，10.0，20.0，40.0和60.0 mg/L的溶液中虎纹蛙的死亡率为6.67％，20.00％，36.67％，46.67和100.00％;在72h Cu2+浓度为8.0，10.0和20.0虎纹蛙的死亡率为40％，53.33％和100.00％;在96h Cu2+浓度为8.0，10.0和20.0虎纹蛙的死亡率为46.67％，80％和100.00％。
　　(2)在TCA循环中随着Cu2+浓度的增加和暴露时间的延长，时间和浓度因素对ICDHm活性影响无显著性交互作用(P＞0.05)，暴露时间的延长对ICDHm活性无显著性影响(P＞0.05)，但随着Cu2+浓度的增加ICDHm活性逐渐减小;而时间和浓度因素对α-KGDH活性影响有显著交互作用(P＜0.05)，暴露处理后α-KGDH活性下降，分别在24h和96h的4.0、6.0 mg/L时活性最低。
　　(3)在自由基代谢中，时间和浓度因素对抗·O2-活性、H2O2含量影响有显著交互作用（P＜0.05），而对抑制·OH活性、NO含量、NOS活性的影响无显著性交互作用（P＞0.05）。不同时间随着Cu2+浓度的增加，抗·O2-活性均呈现出逐渐下降的趋势;实验处理后H2O2含量升高，在24h的6.0 mg/L时活性最大;随着暴露时间的延长和Cu2+浓度的增加抑制·OH活性均逐渐降低;而NO含量和NOS活性的变化趋势基本相同，即随着Cu2+浓度的增加先增加后减少并趋近0浓度组，且都在6.0 mg/L时达到最大。
　　结论:
　　(1)Cu2+对虎纹蛙的24h半致死浓度(24h LC50)为62.5 mg/L，48h LC50为24.7 mg/L，72h LC50为9.5 mg/L，96h LC50为8.2 mg/L。随着时间的延长，Cu2+对虎纹蛙的半致死浓度逐渐下降。Cu2+对虎纹蛙的安全浓度为0.82mg/L。
　　(2)在急性Cu2+暴露实验中，Cu2+影响虎纹蛙肝脏线粒体中TCA循环关键酶ICDHm和α-KGDH的活性，可以推测Cu2+可通过降低TCA循环的转化效率，抑制虎纹蛙能量代谢，降低虎纹蛙的成活率。
　　(3)在急性Cu2+暴露实验中，Cu2+不仅通过降低虎纹蛙肝脏线粒体中抗自由基的生成能力，而且增加线粒体中自由基含量破坏线粒体中自由基代谢的平衡，造成线粒体结构和功能损害，影响虎纹蛙的生存状况。

目录

摘要

第一章 综述

1 线粒体中三羧酸循环

2 线粒体中自由基代谢

2．1 自由基的生成

2．2 线粒体自由基代谢的清除和控制

3 Cu2+对动植物的影响

3．1 Cu2+对动物的影响

3．2 Cu2+对植物的影响

4 立项依据

5 研究目的与意义

5．1 研究目的

5．2 研究意义

6 技术路线

第二章 虎纹蛙对铜离子的急性毒性应激效应

1 实验方法

1．1 实验动物

1．2 实验设计

1．3 数据处理

2 实验结果

2．1 虎纹蛙对Cu2+的应激现象及形态变化

2．2 Cu2+对虎纹蛙的半致死浓度

3 讨论

第三章 铜离子对虎纹蛙肝脏线粒体中TCA循环的影响

1 实验方法

1．1 实验试剂

1．2 实验仪器

1．3 实验设计

1．4 样品制备

1．5 指标检测

1．6 数据处理

2 实验结果

2．1 Cu2+对ICDHm活性的影响

2．2 Cu2+对α-KGDH活性的影响

3 讨论

第四章 铜离子对虎纹蛙肝脏线粒体中自由基代谢的影响

1 实验方法

1．1 实验设计

1．2 指标检测

1．3 数据处理

2 实验结果

2．1 Cu2+对anti-·O2-活性的影响

2．2 Cu2+对过氧化氢含量的影响

2．3 Cu2+对inhabit-·OH活性的影响

2．4 Cu2+对NO含量的影响

2．5 Cu2+对NOS活性的影响

3 讨论

参考文献

攻读学位期间发表的研究论文

攻读学位期间参加的科研项目

致谢

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