利用易感品种丽江新团黑谷研究水稻抗瘟分子机理

摘要

水稻是重要的粮食作物，水稻产量的稳定不仅关系到人民群众生活的稳定，还对国家具有重要的战略意义。因此，维持水稻产量的稳定及增长是农业研究的重要内容。水稻生长过程中不可避免的会遭遇各种生物及非生物胁迫，其中生物胁迫中病害对水稻生长的影响是非常巨大的。在病害中，水稻稻瘟病是水稻三大病害之一，对水稻的安全生产具有严重威胁。发掘抗性水稻是最为经济和环保的方式，但要最终很好的利用水稻自身的抗性需要对水稻抗性发生的过程及分子机理有深入的了解。尽管我们目前已经分离到了许多水稻稻瘟病抗性相关基因，但是关于水稻抗瘟性的研究还需要进一步深入探究。
　　粳稻丽江新团黑谷是一个非常特殊的水稻品种，到目前为止，所有在丽江新团黑谷上接种的稻瘟菌菌株均能使丽江新团黑谷感病，尽管感病程度不尽相同，但是丽江新团黑谷没有表现出对任何菌株的抗性，因此，丽江新团黑谷非常适合担当“零背景”的遗传材料。此外，关于水稻丽江新团黑谷的感病性研究报道较少。本研究针对丽江新团黑谷的易感性利用生理指标测定，基因组序列高通量重测序，蛋白质组学研究力图对水稻丽江新团黑谷的易感性进行研究，主要获得的研究结果总结如下:
　　1)利用水稻国家数据库及相关发表文献，确定目前已经克隆及有相关功能研究的水稻稻瘟病抗性相关基因共计60个，包括R基因及其他与抗瘟性有关的基因。相关基因的确定为进一步确定丽江新团黑谷中相关基因是否在基因组序列中变异提供基础;
　　2)为了了解丽江新团黑谷在抗性生理上表现的差异，本研究针对稻瘟菌侵染后的丽江新团黑谷和感病品种原丰早、抗病品种谷梅二号在超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷胱甘肽还原酶(GR)、过氧化物酶(POD)、羟自由基、脯氨酸(PRO)九个生理指标上的差异进行了测定。研究表明，不同生理指标在不同品种间的表现大不相同，易感品种的抗氧化能力要弱于抗性品种。
　　3)为了了解感病品种丽江新团黑谷基因组与其他水稻品种间的差异，本研究利用高通量测序技术对感病品种丽江新团黑谷进行了基因组重测序。并对其结果进行了全基因组的INDEL和SNP分析。结果表明丽江新团黑谷中已克隆的稻瘟病抗性基因与参考序列日本晴中存在一定的差异，但是在外显子处没有出现INDEL变异，SNP出现的概率和频率也不高。同时对存在差异的基因进行分析表明存在INDEL的基因，拥有大量SNP位点的基因。
　　4)本研究还利用蛋白质组学研究丽江新团黑谷感染稻瘟菌后的蛋白表达变化。研究表明，两次实验重复中共有416个共同的发生差异的蛋白。利用GO分类进行了差异蛋白的分类，研究这些差异蛋白。
　　研究结果发现丽江新团黑谷在已克隆的稻瘟菌抗性基因上表现的差异与其他品种并不显著，同时抗性诱导蛋白中也具有很多抗病相关的蛋白，关于丽江新团黑谷易感性的来源还需要进一步深入的研究。

目录

论文说明

摘要

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缩略表

第一章 文献综述

1．1 水稻抗病先天屏障

1．2 水稻抗病信号传导途径

1．2．1 离子通道

1．2．2 GTP结合蛋白(G蛋白)

1．2．3 蛋白激酶

1．2．4 E3泛素连接酶

1．2．5 锌指蛋白

1．2．6 天冬氨酸蛋白酶

1．2．7 质膜蛋白和胞质蛋白的可逆磷酸化和去磷酸化

1．2．8 促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的激活

1．2．9 NADPH氧化酶激活和活性氧产生

1．2．10 转录因子的活化

1．3 水稻稻瘟病抗性相关基因

1．3．1 稻瘟病主效抗性基因

1．3．2 稻瘟病微效抗性基因

第二章 水稻抗瘟相关基因的发掘

2．1 材料与方法

2．1．1 已克隆基因的搜索

2．1．2 基因富集分析

2．1．3 芯片数据的获得

2．1．4 芯片表达验证

2．2 结果与分析

2．2．1 已克隆水稻抗瘟基因的获得

2．2．2 稻瘟病抗性基因的表达模式分析

2．2．3 稻瘟病抗性基因在不同条件下的表达分析

2．3 讨论

第三章 稻瘟菌接种后生理指标测定与分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 供试菌株

3．1．3 水稻培养

3．1．4 培养基及培养条件

3．1．5 水稻接种

3．1．6 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

3．1．7 丙二醛(MDA)活性测定

3．1．8 谷胱甘肽(GSH)活性测定

3．1．9 过氧化氢酶(CAT)活性测定

3．1．10 谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定

3．1．11 谷胱甘肽还原酶(GR)活性测定

3．1．12 过氧化物酶(POD)活性测定

3．1．13 羟自由基活性测定

3．1．14 脯氨酸(PRO)活性测定

3．1．15 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

3．2．2 丙二醛(MDA)活性变化

3．2．3 谷胱甘肽(GSH)活性变化

3．2．4 过氧化氢酶(CAT)活性变化

3．2．5 谷氨酰胺合成酶(GS)活性变化

3．2．6 谷胱甘肽还原酶(GR)活性变化

3．2．7 过氧化物酶(POD)活性变化

3．2．8 羟自由基活性变化

3．2．9 脯氨酸(PRO)活性变化

3．3 讨论

第四章 丽江新团黑谷基因组重测序分析

4．1 材料与方法

4．1．1 水稻材料

4．1．2 重测序

4．1．3 数据分析

4．1．4 基因功能分类分析

4．2 结果与分析

4．2．1 测序质量质控

4．2．2 测序覆盖度统计

4．2．3 样本突变统计

4．2．4 变异注释

4．2．5 与已克隆水稻稻瘟病抗性基因的比较

4．2．6 差异基因功能分类

4．3 讨论

第五章 丽江新团黑谷稻瘟菌侵染蛋白质组学分析

5．1 材料与方法

5．1．1 实验菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 菌株保存

5．1．4 菌株活化及菌丝培养

5．1．5 水稻培养

5．1．6 水稻接种

5．1．7 蛋白质提取

5．1．8 蛋白样品处理及肽段标记

5．1．9 色谱质谱方法

5．1．10 质谱参数的设定

5．1．11 数据分析

5．1．12 生物信息学分析

5．2 结果与分析

5．2．1 Guy11对黑谷的致病性

5．2．2 差异蛋白的获得

5．2．3 差异蛋白的功能分类

5．3 讨论

第六章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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