利用转录组测序筛选控制白色獭兔皱襞性状相关基因

摘要

獭兔，典型的皮用兔，因被毛独特而倍受人们喜爱。近年来，在生产中发现，某些獭兔会在腹部和四肢以及臀部出现皱褶，称其为皱襞型獭兔。皱襞型獭兔的个体比非皱襞型稍大，同时具有正常獭兔相同的皮毛品质，这对于以皮张面积和皮毛品质为重要经济效益因素的獭兔来说，意义重大，提供了新的獭兔育种方向。
　　本研究采用RNA-Seq技术，对皱襞型（试验组）和非皱襞型（对照组）白色獭兔的皮肤样本进行测序分析。分析测序结果，筛选出与皮肤生长发育相关的基因。将样本的有效reads合并，通过Trinity软件，使用两端重复进行de novo拼接。两组皮肤样本测序总共获得377，618条Unigenes，Unigenes的平均长度是680 nt，最长的序列长达20，293 nt。
　　将Unigenes与NR、Swiss-Prot、KEGG和KOG等数据库比对(E-Value＜10-5)，根据比对的注释，分析已知Unigene的功能。由于家兔的全基因组信息还不完善，85.5931％序列无法比对到任何数据库上。根据NR注释及Blast2GO，总共有42，895条Unigene被映射到不同的GO term上，并按照分子功能、细胞组分及生物过程将其分类;KOG的结果显示60，593条Unigenes被分为25类。KEGG数据库比对显示，13，431条Unigene分别被注释到399个KEGG pathway中，其中注释到PI3K-Akt信号通路(ko04151)的基因最多(686，5.108％)，该信号通路在皮肤的生长发育过程中具有重要的意义。
　　两种不同表型的样本中，共有308个显著的差异表达基因(P-Value≤0.05且log2|foldchange|＞1)，其中118个在皱襞型样品中为上调基因，190个为下调基因。这些基因中有99个被注释到不同的GO Term上，其中只有29个基因被注释到KEGG不同的代谢途径中。除此之外的209个基因被称为新基因，在这些基因中，33个只在非皱襞型个体中表达，56个基因只在皱襞型个体中表达。
　　通过qRT-PCR验证测序结果。选择7个候选基因，使用oligo7.0设计特异性引物，采用ΔΔCt法计算皱襞型和非皱襞型样品的相对表达量。结果显示，qRT-PCR的结果和转录组测序的结果相符。说明测序结果是正确的，据此初步确定与家兔皮肤发育相关的基因:MYL12B、LAMB3、PLON，EIF3E、CEBPA、FADS2,ENPP6等。
　　候选基因MYL12B是细胞骨架的重要组分，作为肌球蛋白的调节性轻链，可通过调节轻链的磷酸化与去磷酸化，调节细胞的许多动力学过程。本研究克隆了MYL12B基因的CDS序列，并与人、黑猩猩、小鼠等12个物种的CDS序列和氨基酸序列进行比较。发现，除马外，该基因与哺乳动物CDS相似性高达94％，与鸟类和两栖类的同源性也较高。生物信息学分析显示MYL12编码的蛋白是一个不稳定的、具有一定亲水性的结构蛋白，同时富含磷酸化和糖基化位点。同时该基因的CDS序列在皱襞型和非皱襞型的个体中没有序列的差异，表达量的差异可能是由肌球蛋白作用机制决定的。
　　本研究采用PCR-SSCP技术，设计候选基因LAMB3第5、6、7、8、9和10等外显子的特异性引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，将不同带型的PCR产物送生物工程公司测序，结果发现LAMB3第8外显子存在1个潜在的突变位点，通过统计分析，这些突变位点在皱襞型和非皱襞型白色獭兔的皮肤组织样品中具有显著性差异。
　　本研究首次将转录组测序技术应用于白獭兔皱襞性状的探索中，初步确定与皱襞性状相关的基因，并通过该基因的功能注释分析，了解该基因在皮肤的生长发育过程中的作用方式和途径，为进一步研究该基因在分子和蛋白质层面的功能和作用机制提供了依据。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

引言

1 品种概况

1．1 獭兔体型外貌及生活习性

1．2 獭兔繁殖性能

1．3 獭兔毛皮性能

1．4 獭兔产肉性能

1．5 皱襞型白色獭兔

2 高通量测序

2．1 转录组测序

3 皮肤生长发育

3．1 皮肤发育过程中的生长因子

3．2 皮肤发育过程中的代谢通路

4 候选基因的选择

5 单核苷酸多态性

第二章 转录组测序筛选皱襞型獭兔皮肤生长发育相关基因

1 材料

1．1 试验兔和采样方法

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂

2 试验方法

2．1 RNA的提取和纯化

2．2 cDNA文库制备和Solexa测序

2．3 Unigene的组装和功能注释

2．4 差异基因的筛选和功能富集

2．5 荧光定量PCR(qRT-PCR)验证

3 结果

3．1 Unigenes组装分析

3．2 Unigenes的功能注释

3．3 皱襞型和非皱襞型獭免中的差异表达基因

3．4 KEGG分析和荧光定量验证

4 讨论

5 本章结论

第三章 候选基因MYL12B CDS序列克隆及生物信息学分析

1 材料

1．1 试验材料

1．2 试验试剂

1．3 试验仪器

2 方法

2．1 RNA提取

2．2 引物设计

2．3 MYL12B基因cDNA的合成及扩增

2．4 MYL12B基因的T-A克隆

2．5 生物信息分析

3 结果

3．1 MYL12B基因克隆

3．2 菌液PCR鉴定

3．3 MYL12B基因序列与其他物种的相似性分析

3．4 MYL12B基因的系统发育分析

3．5 MYL12B蛋白特性分析

4 讨论

4．1 家兔MYL12B基因在物种间相对保守

4．2 MYL12B是一个亲水的结构蛋白

4．3 MYL12B富含磷酸化和糖基化修饰

5 本章结论

第四章 候选基因LAMB3外显子8多态性及其与皱襞性状的相关性分析

1 材料和方法

1．1 试验材料和仪器

1．2 试验方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 PCR-SSCP检测结果

2．2 序列分析

2．3 不同群体外显子8遗传多样性分析

2．4 突变前后的LAMB3蛋白结构

3 讨论

4 本章结论

第五章 全文总结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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