中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白基因克隆与功能初鉴

摘要

富含甘氨酸RNA结合蛋白(Glycine-rich RNA-binding Protein，GRPs)是一种N端具有一个或者多个RNA识别基序和C末端富含甘氨酸区域的结合蛋白，可以响应外界刺激，参与植物应激反应，调控植物的生长发育和提高植物的抗逆能力。
　　本研究从中国樱桃(Prunus pseudocerasus)转录组数据库中筛选得到3个GRP编码基因，对其进行生物信息学分析，根据同源性比对结果，分别命名为PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7。利用实时定量PCR技术(Real-time PCR)分析PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7基因在低温胁迫下中国樱桃花芽和叶片中的表达特性。利用PCR技术分离了樱桃PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7的cDNA基因全长序列，并构建了植物表达载体。利用农杆菌介导花序浸染法将3个基因分别转入拟南芥中，初步研究该基因的功能，主要取得以下研究结果:
　　1.根据测序结果，获得注释为富含甘氨酸RNA结合蛋白基因序列，利用NCBI在线分析软件Open Read Frame Finder分析了基因开放阅读框，PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7分别编码141、140和179个氨基酸。从其氨基酸数量、蛋白质二级结构等生物信息学分析可知，PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7其等电点均大于7，均为碱性蛋白质。PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7不稳定指数分别为39.3、55.07、62.92。氨基酸分子量之间存在差异，而原子组成、脂肪指数和总平均疏水性等性质差异不大，均为疏水性蛋白。对其蛋白质二级结构分析发现，这3个富含甘氨酸RNA结合蛋白都具有α螺旋、β转角、无规卷曲、延伸链等结构。而PpcGRP4和PpcGRP6以α螺旋所占比例较大。从TMHMM的跨膜区预测结果看，PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7的蛋白均无跨膜区域，蛋白基本都在膜外。蛋白的亚细胞定位预测结果表明:PpcGRP4主要定位在细胞核中，PpcGRP6主要定位在线粒体中，PpcGRP7在细胞质中，且在细胞核、线粒体、细胞质中的分布占有不同比例。通过与其它植物相关基因进行同源性比对发现，它们与梅（Prunus mume）和碧桃（Prunus persica）的GRPs具有较高的亲缘关系。
　　2.利用Real-time PCR技术分别对PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7基因在低温胁迫下的中国樱桃花芽和叶片中表达特性进行分析。结果表明，在低温胁迫条件下，花芽和叶片中PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7基因的表达量均呈先上升后下降的趋势，最高可上调34倍。由此认为PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7基因对低温具有明显响应，但响应程度存在明显差异。PpcGRP7对低温的相应程度最高，PpcGRP6次之，最后是PpcGRP4。
　　3.利用PCR技术分离了PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7全长cDNA，并分别构建了植物表达载体，利用花序浸染法遗传转化拟南芥，获得了稳定遗传的转基因株系T1代。以野生型拟南芥和转基因拟南芥种子为实验材料，进行种子萌发试验。结果表明，种子萌发48h时，超表达PpcGRP6和超表达PpcGRP7种子萌发率分别为38.9％和25.1％，而野生型种子萌发率为9.3％，超表达PpcGRP6和超表达PpcGRP7显著促进种子萌发。但超表达PpcGRP4拟南芥种子的萌发率为14.8％与野生型拟南芥种子差异不显著。
　　4.为更加深入研究中国樱桃PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7基因的功能，分别测定低温处理不同时间下转基因拟南芥和野生型拟南芥中电解质外渗率和丙二醛含量(Malondialdehyde，MDA)。结果表明，在低温胁迫下，T1代转基因植株叶片的电解质外渗率和MDA都随着时间的延长呈先上升后下降的趋势，根据拟南芥叶片电解质外渗率的变化率和拟南芥叶片8h时MDA含量的积累量，推测中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白基因PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7基因在转基因拟南芥中表达可以增强细胞膜氧化能力，进而提高抗寒能力。
　　通过以上研究结果，明确了部分中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白基因的结构特征、表达特性及功能，为植物抗逆研究提供一定的理论依据。

目录

摘要

第一章文献综述

1．富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRPs)的结构

1．1组成和命名

1．2二级结构预测

2 GRPs的功能

2．1作为细胞外基质成分

2．2作为连接细胞壁-细胞骨架之间的桥梁

2．4膜脂结构的稳定性

3植物中富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRPs)

3．1 GRPs在细胞壁结构中的作用

3．2 GRPs在植物防御中的作用

3．3 GRPs在渗透胁迫中的作用

3．4 GRPs在冷应激中的作用不局限于具有冷休克区

3．5 GRPs在开花时间控制和发育中的作用

3．6 GRPs在细胞伸长中的作用

4 研究目的与意义

第二章 中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白基因的生物信息学分析

1 前言

2材料与方法

2．1基因序列来源

2．2基因序列的生物信息学分析

3．结果分析

3．1中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRPs)基因的生物信息学分析

3．2中国樱桃GRPs基因系统进化树以及同源性分析

4．讨论

第三章中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白基因的克隆与表达分析

1 前言

2材料与方法

2．1材料

2．2实验方法

3结果分析

3．1中国樱桃总RNA提取

3．2中国樱桃PpcGRPs基因的菌液验证

3．3 低温处理下樱桃花芽中PpcGRPs 基因的表达分析

3．4低温处理下樱桃叶片中PpcGRPs基因的表达分析

4讨论

第四章中国樱桃富含甘氨酸RNA结合蛋白基因在拟南芥中的功能初鉴

1前言

2材料与方法

2．1植物材料

2．2载体和菌株

2．3试剂

2．4相关试剂及培养基的配制

2．5拟南芥遗传转化的研究

2．6拟南芥抗性种子筛选与鉴定

2．7低温胁迫下转基因拟南芥的抗寒性分析

3结果分析

3．1拟南芥转基因抗性苗PCR检测

3．2 PpcGRPs转基因拟南芥对种子萌发的影响

3．3低温处理不同时间下转基因拟南芥的电解质外渗率

3．4低温处理不同时间对转基因拟南芥中MDA的影响

4讨论

结果与展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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