半夏与掌叶半夏凝集素组成比较及特性研究

摘要

半夏和掌叶半夏均为单子叶植物，同属于天南星科、半夏属。它们为传统中药材。主要活性成分除活性多糖、生物碱外，还有蛋白质。其中，凝集素是它们总蛋白的重要组分之一。现已发现的半夏和掌叶半夏的凝集素属于单子叶植物中甘露糖凝集素家族。本项研究就是针对半夏及掌叶半夏中的凝集素成分来展开的，包括总蛋白和凝集素的提取和抗虫、抗植物病毒活性研究以及半夏和掌叶半夏的凝集素性质、组成成分的差异比较等重点研究内容。 硫酸铵盐析比丙酮沉淀能更好地分离总蛋白。用硫酸铵分离方法得到了总蛋白后，再将总蛋白过猪甲状腺球蛋白甘露糖亲和层析柱。亲和层析中，先用纯水洗脱，后用8 M脲洗脱。分别收集纯水和8M尿素的洗脱峰组分，冰冻干燥，获得凝集素样品。 为弄清两种半夏的凝集素组成成分及其特征，进行了SDS-PAGE、双向电泳、等电点测定和质谱分析。SDS-PAGE表明，它们的总蛋白主要含有分子量约为12kD、24kD及46kD的成分，推测为凝集素的单体及其二聚体和四聚体。经双向电泳、等电点分析，结果显示半夏仅有一种凝集素，分子量约为12kD、pI约为5.9，但掌叶半夏含有两种凝集素组分，这两种组分分子量近乎一致，均约为12kD，但pI值不同，分别为pI 5.9和pI 6.1。质谱分析发现，两种半夏均有一种分子量为12,065 Da的凝集素，掌叶半夏中独有一种分子量为11，905Da的凝集素，这一结果与双向电泳一致。以上结果一致表明，两种半夏的凝集素成分的组成存在显著差异，它们的主要组分，除均有单体分子量为12,065 Da、pI 5.9的成分外，半夏中还有12,659 Da的成分，掌叶半夏中还有11，095：Da、pI 6.1的成分，推测该11，905Da成分是一种新的凝集素。 对兔血红细胞的凝集实验表明，半夏和掌叶半夏的凝集素的平均最低凝集浓度为 0.4μg·ml<'-1>，总蛋白的平均最低凝集浓度为1.56 μg·ml<'-1>，表明分离到的凝集素具有较高的生物活性。单糖特异性结合实验表明，62.5mM的甘露糖能有效抑制16倍凝集滴度的凝集素对兔血红细胞的凝集，而半乳糖和葡萄糖的浓度在250mM时仍无抑制效果，该结果表明所分离的凝集素能与甘露糖专一结合。 稳定性实验表明，半夏和掌叶半夏的凝集素对热和酸碱均具有相当的稳定性。它们在60℃水浴90min后，仍能保持活性不变，但随着处理温度的升高和时间的增长，活性会逐渐丧失。酸碱处理表明，pH6.0—10.0，它们的活性完全稳定，pH4.0-5.0，其活性完全丧失，pH2.0-4.0或pH10.8-12.0，其活性部分丧失。对番茄花叶病毒侵染力的抑制实验表明，半夏和掌叶半夏的凝集素在0.2 mg.ml<'-1>时、总蛋白在1mg·m<'-1>。时能有效抑制一定浓度的病毒汁液对心叶烟的侵染，抑制率分别达50﹪和70﹪左右，但不能有效抑制高浓度病毒汁液的侵染力，表明它对病毒有一定的抑制作用。 对褐飞虱的致死作用实验表明，在1mg-m<'-1>。浓度下，总蛋白均对褐飞虱若虫有显著致死效应，处理两天的校正死亡率即达62﹪以上，处理四天时，校正死亡率均在96﹪左右，半夏和掌叶半夏的差异不显著。0.1mg-ml<'-1>及以下浓度，对褐飞虱致死作用不明显。

目录

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论文说明：略语表

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第一章半夏和掌叶半夏作为药材方面的研究

1.1半夏和掌叶半夏的形态特征

1.2半夏和掌叶半夏的化学成分

1.3半夏和掌叶半夏的药用功效

1.4半夏的炮制和入药

1.5半夏的毒副作用

1.6小结

第二章凝集素研究进展

2.1凝集素的研究简史和分类

2.2凝集素的性质与分离方法

2.3凝集素的结构与功能研究

2.4凝集素的应用与发展前景

2.5小结

第三章半夏及掌叶半夏中蛋白质和凝集素的研究

3.1半夏和掌叶半夏的蛋白质的研究

3.2半夏和掌叶半夏的凝集素的研究

第四章前言

4.1研究意义和目的

4.2研究重点

4.3创新点

第五章材料、试剂及仪器

5.1材料

5.2试剂

5.3仪器

第六章总蛋白的分离和凝集素的纯化与鉴定

6.1方法

6.1.1总蛋白的分离

6.1.2凝集素的纯化

6.1.3产物的SDS-PAGE分析

6.1.4凝集素的鉴定

6.2结果与讨论

6.2.1总蛋白的分离

6.2.2凝集素的纯化

6.2.3产物的SDS-PAGE分析

6.2.4凝集素的鉴定

6.3小结

第七章半夏和掌叶半夏的凝集素组成成分的差异比较

7.1方法

7.1.1双向电泳分析

7.1.2等电点测定

7.1.3质谱分析

7.2结果与讨论

7.2.1双向电泳分析

7.2.2等电点测定

7.2.3质谱分析

7.3 小结

第八章凝集素的抗植物病毒、抗虫作用研究

8.1方法

8.1.1抑制病毒（ToMV）侵染活性实验

8.1.2褐飞虱致死作用实验

8.2结果与讨论

8.2.1病毒抑制实验

8.2.2褐飞虱致死作用实验

8.3小结

第九章凝集素的稳定性研究

9.1方法

9.1.1温度稳证性测定

9.1.2酸碱稳定性测定

9.2结果与讨论

9.2.1热稳定性实验

9.2.2酸碱稳定性实验

9.3小结

全文总结

参考文献

致谢

附录A：常用母液的配制

附录B：2D-E电泳方法

附录C：学位论文发表情况