胶质芽孢杆菌质粒的稳定性及其生物学特性

摘要

胶质芽孢杆菌因具有溶钾解磷固氮等多种功能，已广泛应用于农业生产，在冶金、陶瓷、废水处理等领域也显示了广阔的应用前景。迄今，有关胶质芽孢杆菌分子机制研究一直较薄弱，导致高效菌株的筛选和优化缺乏有效的筛选标记，功能调控与工程菌的构建和分子改造也缺乏理论依据，严重制约了菌种性能的提高及其应用。本论文探讨了胶质芽孢杆菌质粒的稳定性及生物学特性，并初步探索了质粒的功能，为其分子机制研究奠定初步基础。
　　 首先，在确定胶质芽孢杆菌质粒提取方法的基础上，检测了20株胶质芽孢杆菌的质粒。以麦芽糖为碳源，添加2‰(NH4)2SO4，在Aleksandrov培养基中培养14～16h的菌体，用四种方法--碱裂解法、改进Kronstacl法、SDS法、试剂盒分别提取胶质芽孢杆菌质粒，结果试剂盒和SDS法适于胶质芽孢杆菌质粒的提取，其中试剂盒法提取的质粒纯度较高，适用于后续分子生物学实验，SDS法稳定性好，适用于质粒检测。采用SDS法检测20株胶质芽孢杆菌的质粒，发现16个菌株含有约7000bp的质粒pBM1，其中菌株BM2另含有一个约6000bp的质粒pBM2。酶切图谱分析表明，质粒pBM1和pBM2均可被Bam.I、PstI、HindIII和Eco.V等酶切，酶切位点为1～2个。可见，胶质芽孢杆菌中普遍存在环状质粒pBM1。荧光扫描法粗略测定了胶质芽孢杆菌BM2质粒的拷贝数，结果质粒pBM1(7kb)的平均拷贝数为11，质粒pBM2(6kb)的平均拷贝数为10，表明菌株BM2的质粒为低拷贝质粒。
　　 胶质芽孢杆菌稳定性较差是影响其应用的一个重要因素。以菌株BM2和BM4为材料，考察了胶质芽孢杆菌质粒在各种条件下的稳定性，结果胶质芽孢杆菌质粒在不同营养(碳源、氮源)、培养条件(温度、盐度)及连续转接过程中都较稳定。30～37℃培养，菌株BM2和BM4的质粒保持稳定；40℃培养，质粒稳定性显著降低；菌株BM2耐盐性差(<1％NaCl)，0.1～0.6.NaCl对菌株BM2的质粒无影响；氮源、碳源对菌株BM2和BM4生长及其质粒没有影响；传代对菌株BM2或BM4的生长及质粒均无影响，连续转接30次后，菌株固氮、溶磷解钾活性在转接前后无差别。可见，胶质芽孢杆菌的质粒具有较高的稳定性。
　　 采用SDS-高温法和吖啶橙法分别对胶质芽孢杆菌BM2进行质粒消除。37℃高温结合不同浓度SDS处理菌株BM2，0～0.002％SDS抑制菌株生长，其致死浓度为0.0025％.SDS处理后，菌株BM2的菌落直径比对照大。吖啶橙处理，显著抑制菌株生长；200μg.ml-1处理48h，致死率100％。但两种处理均不能将质粒pBM1和pBM2消除，表明这两种方法不适用于胶质芽孢杆菌的质粒消除。比较含质粒菌株7519、BM2和无质粒菌株1.3714、SB的生长、固氮、溶磷解钾活性，结果发现含质粒菌株的生长情况、固氮活性及溶磷解钾活性均高于无质粒菌株，表明质粒与固氮、溶磷解钾活性具有一定的相关性，但该质粒的确切功能有待于进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1 胶质芽孢杆菌的概况

1.1 胶质芽孢杆菌的发现及分类地位的确定

1.2 胶质芽孢杆菌的形态特征

1.3 胶质芽孢杆菌的功能

1.4 胶质芽孢杆菌的应用

1.5 胶质芽孢杆菌解钾机理的研究

2 细菌质粒的基本特征及功能

2.1 质粒的基本特征

2.2 质粒的功能

3 质粒消除方法

3.1 物理消除法

3.2 质粒不相容消除法

3.3 原生质体再生法

3.4 化学试剂消除法

3.5 中草药质粒消除法

4 研究目的和意义

第二章 胶质芽孢杆菌质粒的鉴定

1 材料

1.1 供试菌株

2 方法

2.1 质粒提取方法的确定

2.2 胶质芽孢杆菌质粒的调查

2.3 胶质芽孢杆菌质粒酶切图谱分析

3 结果与分析

3.1 胶质芽孢杆菌质粒提取方法的确定

3.2 胶质芽孢杆菌质粒的检测

3.3 胶质芽孢杆菌质粒酶切图谱分析

4 小结与讨论

第三章 质粒拷贝数的测定

1 材料

1.1 供试菌株

2 方法

2.1 细菌培养

2.2 细菌计数

2.3 DNA提取及其浓度(Mc)测定

2.4 质粒DNA与细菌总DNA比率(P)的测定

3 结果与分析

3.1 细菌浓度(C)

3.2 DNA浓度(Mc)

3.3 质粒DNA与细菌总DNA峰面积的比率(P)

3.4 质粒拷贝数(Cp)

4 小结与讨论

第四章 胶质芽孢杆菌质粒的稳定性

1 材料

1.1 供试菌株

2 方法

2.1 在不同温度下的稳定性

2.2 在不同盐度下的稳定性

2.3 氮源对质粒稳定性的影响

2.4 碳源对质粒稳定性的影响

2.5 质粒在传代中的稳定性

3 结果与分析

3.1 在不同温度下质粒的稳定性

3.2 不同盐度下质粒的稳定性

3.3 氮源对质粒稳定性的影响

3.4 碳源对质粒稳定性的影响

3.5 质粒在传代中的稳定性

4 小结与讨论

第五章 胶质芽孢杆菌质粒的消除及其功能初探

1 材料

1.1 供试菌株

2 方法

2.1 质粒消除方法

2.2 质粒功能初探

3 结果与分析

3.1 SDS—高温处理法消除菌株质粒

3.2 吖啶橙处理法消除菌株质粒

3.3 质粒功能初探

4 小结与讨论

总结

参考文献

致谢

附录

硕士期间发表的论文