家蚕30kD载脂蛋白19G1的表达和功能的初步研究

摘要

30K蛋白家族是一类在氨基酸组成及免疫学活性上相似的蛋白,分子量约为30 kD。家蚕30K蛋白是由脂肪体合成的非雌特异性脂蛋白,表达受保幼激素的调节,是生长发育过程中主要储藏蛋白之一,是五龄幼虫及蛹主要的蛋白组分,主要分布在血淋巴中。对雌性家蚕,30K蛋白还是卵黄原蛋白的重要组成部分。30K蛋白中研究比较多的是30 kD载脂蛋白6G1和19G1。Kim EJ与Park HJ别把家蚕30Kc6基因构建入表达载体在大肠杆菌中表达得到重组蛋白,纯化后添加到哺乳动物及昆虫细胞培养基中,能抑制哺乳动物及昆虫细胞的凋亡;KooTY[5]等构建了表达重组30Kc6基因的生产干扰素的CHO细胞系,结果表明30Kc6基因的表达抑制细胞的凋亡并提高干扰素的产量。
　　 本研究从家蚕蛹cDNA文库中通过生物信息学分析发现一条低分子量30 kD载脂蛋白19G1前体(low molecular mass30 kD lipoprotein19G1 precursor)的EST序列(GenBank登录号:AY568957)。生物信息学分析结果表明该基因ORF不含内含子,由长为771 bp的单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量约为29.5 kD,等点电为7.290。我们将其ORF克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒,双酶切鉴定及序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达的重组蛋白以包涵体形式存在,经过镍柱亲和层析纯化后获得高纯度的目的蛋白,以该重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测,抗体效价可达1:12800,Western blotting结果显示抗体的特异性较好。
　　 提取家蚕各个时期和五龄幼虫各组织的总RNA分别进行荧光定量PCR分析结果表明,家蚕发育时期在蛹期转录水平最高,卵中最低;五龄幼虫时期在脂肪体中转录水平较高,丝腺和肠较低。提取家蚕各发育时期以及家蚕五龄幼虫各组织蛋白进行Western blotting分析,结果表明,该蛋白在家蚕蛹中及五龄幼虫的脂肪体、卵巢表达较高。
　　 把纯化的蛋白添加到家蚕Bm5细胞培养基中,结果表明重组30 kD载脂蛋白19G1能抑制化学试剂(地塞米松)诱导的家蚕Bm5细胞的凋亡。