水半夏组织培养、光合特性和miRNA研究

摘要

水半夏(Typhonium flagelliforme(Lodd.)Blume.)为天南星科独角莲属植物,为我国常见中药材,药用历史悠久,具有较高药用和经济价值。本论文以水半夏为实验材料,进行了一系列的相关性研究,建立一套水半夏的研究平台,主要涉及水半夏组织培养、光合特性以及miRNA检测分析。
　　 本研究建立一套水半夏组培快繁体系,并对其操作流程进行规范化和标准化要求,为水半夏优良品种的选育和大规模工厂化生产种苗提供技术和方法。本研究以水半夏块茎为外植体,选择不同浓度植物激素配比的培养基进行筛选试验。结果表明,愈伤培养基:MS+NAA0.2mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖3％+琼脂6g/L,可成功诱导水半夏愈伤组织;丛生芽培养基:MS+NAA0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+蔗糖3％+琼脂6g/L,诱导不定芽效果较好,增殖倍数高;生根培养基:1/2MS+NAA0.2mg/L+IBA0.4mg/L+KT0.2mg/L+蔗糖3％+琼脂6g/L+AC0.3g/L,有利于水半夏不定根的快速形成,12～14周即可获得再生水半夏植株。同时,对水半夏一次性成苗的研究表明,诱导水半夏分化一次性成苗的最佳激素配比为:NAA0.2mg/L+6-BA1.5mg/L+蔗糖3％+琼脂6g/L,5～6周可形成试管苗,10周后可用于炼苗。
　　 其次,本课题利用光合分析仪对受黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)侵染的水半夏植株的生长情况、光合气体交换及叶绿素荧光参数变化等进行检测分析,为防治水半夏病毒病提供参考依据。结果显示:CMV对水半夏的植株生长高度、叶片面积、植株重量上均出现抑制作用;感病植株在胞间CO2浓度(Ci)上呈现明显上升,而气孔导率(Gs)和蒸腾速率(E)却显著下降;水半夏叶片中叶绿素含量减少,导致水半夏生长受到抑制。总体而言,CMV侵染水半夏后对其生理状态造成负面影响。与其它已报道的感病植物相似,CMV侵染后水半夏也表现出一系列综合反应。
　　 最后,本研究通过real-time PCR和原位合成微流体芯片技术检测水半夏中的microRNA种类,可填补Sanger miRbase数据库中水半夏miRNA记录空白,为进一步研究其miRNA功能提供支持。Realtime-PCR实验设计了10条miRNA引物,结果显示:这10种miRNA在水半夏组织中均存在但表达量有差异。芯片实验中所用的微流体芯片包含34种植物的1450条成熟miRNA探针序列,杂交结果显示:水半夏在该芯片中的检出率为50.62％,即有734条miRNA在水半夏叶片组织中发生表达。这些miRNA分布于个317个miRNA家族,验证了miRNA分布的广泛性和保守性。设计Real-time PCR初衷是为与芯片实验的结果相互印证,但实际得到的两者实验结果却出现了一定的差异,有待对这两种实验的可靠性、精度进一步分析。