水稻端粒酶RNA候选序列的克隆及特征研究

摘要

端粒酶是一种由端粒酶反转录酶(TERT)和端粒酶RNA(TER)构成的核糖核蛋白复合体，端粒酶RNA中有一段端粒合成时所需要的模板区。传统的DNA复制机制无法完成端粒序列的完整复制，随着细胞的持续分裂，端粒长度会逐渐缩短。端粒酶则可以催化端粒序列的延伸，防止染色体末端降解或融合的发生。
　　 端粒酶主要分布于细胞分裂旺盛的组织中，并对细胞的分裂起着重要的调控作用。完全分化的动植物细胞均不具有端粒酶活力。人体中有些即将衰老的细胞在一些特殊条件下发生逃逸，重新表达端粒酶而成为具有无限增值能力的癌细胞。成熟的植物细胞在诱导成为愈伤组织以及再分化为植株的过程中，也存在着端粒酶的重新表达;端粒酶将染色体末端的端粒序列延长，使得细胞又可以进行分裂增殖。人体中已经实现了以端粒酶RNA为靶标的癌症治疗。然而植物端粒酶在有限组织中的低量表达以及端粒酶RNA复杂的二级结构，造成端粒酶RNA的克隆十分困难。目前，仅获得了拟南芥端粒酶RNA的序列。
　　 本研究的目的是探究一种快速有效的提取植物端粒酶的方法并克隆水稻端粒酶RNA，通过生物信息学技术预测分析水稻与拟南芥端粒酶RNA的转录调控元件，探究植物端粒酶RNA的结构及转录调控机制。由于端粒酶是一种含有RNA链的逆转录酶，长时间的操作容易导致端粒酶失活，而分离的蛋白在酶促反应时不存在端粒酶活力，就无法进行后续的端粒酶RNA序列克隆。核糖体是影响低表达量端粒酶富集及端粒酶RNA克隆的主要因素。我们在研究中利用核糖体大小亚基偶联及解聚的动态平衡受镁离子浓度调控的机制，提高裂解液中镁离子的浓度至15mM，使核糖体大小亚基最大程度的偶联在一起。然后，利用不同浓度的PEG6000能够选择性的沉降不同分子量的生物大分子的性质，设计了0％、2％、4％、6％、8％、10％共6组PEG6000工作浓度，并用PEG6000的这6组工作浓度对裂解液萃取的上清液中的蛋白进行选择性的沉淀，离心后取上清液测定端粒酶活力。结果表明，PEG6000工作浓度为4％时，可以有效的沉淀杂蛋白并且提取液中端粒酶的活力最高。从富集的端粒酶提取液中分离RNA，并用聚丙烯酰胺尿素变性电泳分离。电泳结果显示有效的降低了核糖体18SrRNA和28SrRNA的干扰。
　　 然后，我们从PEG6000工作浓度为4％的条件下得到的端粒酶提取液中提取RNA，并用T4RNA连接酶在RNA的3'端连接单链接头。由于端粒酶RNA的模板区序列可能有多种排列方式，我们在以前实验数据的基础上设计了5种上游引物。通过对PCR体系及程序的优化，我们最终克隆到了大小分别为862bp、292bp、459bp和1040bp的4条目的条带;与水稻基因组数据库进行blast比对发现，292bp的未知序列中含有可以作为端粒序列模板的区域，模板区序列为5'-AAACCCTAA-3'。该模板区可以以AA为锚定位点，以AGGGTTT为复制单元合成端粒重复序列。此外，模板区3'端以AA结尾也与我们之前研究发现的端粒酶在体外延伸时优先合成以TT结尾的引物序列相吻合。因此，我们认为292bp的目的片段很可能是水稻端粒酶RNA的下游序列。
　　 我们通过NCBI中水稻和拟南芥的基因组数据库获取了端粒酶RNA模板区上游1000bp的核酸序列，然后分别使用PromPridect和PLACE数据库对两者的启动子位点和转录调控元件进行了预测分析。结果显示两者具有类似的转录调控元件，在-40～-50bp区均有TATABOX元件;在转录起始位点没有起始密码子ATG，这也与端粒酶RNA为非编码RNA相符。此外两者还都具有CAATBOX、CACT、EBOXNNAPA、GATABOX、DOFCOREZM、POLLEN1LELAT52及ARR1AT等调控转录效率和组织特异性表达的转录调控元件，并且所处位置也相似。研究中获得的端粒酶RNA候选序列将通过构建模板区定点突变的转基因体系进一步鉴定。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 绪论

1．1 端粒与端粒酶的发现

1．2 端粒的结构与功能

1．2．1 端粒序列

1．2．2 端粒末端结合蛋白

1．3 端粒酶的结构与功能

1．3．1 端粒酶概述

1．3．2 端粒酶反转录酶

1．3．3 端粒酶RNA

1．4 端粒酶的研究进展

1．4．1 端粒酶与干细胞

1．4．2 端粒酶与肿瘤

1．4．3 植物端粒酶的研究进展

1．5 植物启动子及转录调控元件的预测与分析

1．6 本研究的目的及意义

1．7 技术路线

第二章 水稻愈伤组织的诱导

2．1 材料与试剂

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 愈伤诱导培养基的配制

2．2．1 成熟胚愈伤诱导

2．2．3 愈伤继代培养

2．3 实验结果

第三章 端粒酶提取方法的优化

3．1 材料与试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 端粒酶的提取

3．2．2 酶促反应

3．2．3 酶促产物的回收

3．2．4 TRAP法测定端粒酶的活力

3．2．5 水稻愈伤组织总RNA的提取

3．2．6 端粒酶粗提液RNA的提取

3．2．6 RNA的尿素变性电泳

3．3 实验结果

3．3．1 端粒酶粗提蛋白浓度

3．3．2 端粒酶活力测定

3．3．3 端粒酶粗提蛋白中RNA组分的尿素变性电泳分析

3．4 讨论

第四章 端粒酶RNA候选序列的克隆

4．1 材料与试剂

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 RNA与接头的连接

4．2．2 连接产物的回收

4．2．3 反转录

4．2．4 PCR扩增

4．2．5 PCR产物的回收

4．2．6 目的片段与pMD18-T载体连接

4．2．7 DH5α感受态细胞的制备及转化

4．2．8 菌落PCR鉴定

4．2．9 质粒提取

4．2．10 酶切鉴定

4．2．11 测序

4．3 实验结果

4．3．1 PCR结果

4．3．1 菌落PCR结果

4．3．2 酶切结果

4．4 讨论

第五章 候选序列启动子及转录调控元件的预测与分析

5．1 数据库

5．2 启动子及转录调控元件的预测

5．2．1 启动子的预测

5．2．2 转录调控元件的预测

5．3 实验结果

5．3．1 启动子区预测结果

5．3．2 转录调控元件预测结果

5．4 讨论

总结

参考文献

附录

水稻愈伤诱导培养基母液的配制

裂解液的配制

酶促缓冲液的配制

攻读学位期间的研究成果

致谢