家蚕表达重组人乳铁蛋白及其口服治疗溃疡性结肠炎药物研究

摘要

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是主要存在于哺乳动物乳汁中的一种铁结合糖蛋白，具有多种生物学功能，已成为在抗病毒、抗肿瘤和抗炎等领域备受瞩目的潜在药物开发对象。目前，用于药物研究的LF主要来源于从哺乳动物乳汁中提取的天然LF和利用基因重组技术得到的重组LF，都需要经过纯化、浓缩等加工过程，不仅产量低，而且工艺复杂、成本高，使药物的开发和大规模生产都受到一定限制。
　　基于家蚕在我国资源丰富，易饲养，家蚕表达系统具有翻译后修饰的功能，且蚕蛹安全、可食等优势，并结合LF具有抗炎和调节机体免疫功能的特点，本研究利用含人乳铁蛋白(hLF)基因的重组杆状病毒感染家蚕蛹，在蚕蛹中表达重组人乳铁蛋白(rhLF)，将表达rhLF的蚕蛹经匀浆、冻干成蚕蛹粉后通过口服对小鼠溃疡性结肠炎(UC)进行治疗，不经纯化，可节省时间，降低成本，以探究一种新型、廉价的治疗UC的方法。首先，将重组病毒vBm-hLF接种蚕蛹，在蚕蛹中成功表达了分子量80kDa左右的rhLF，且表达量最高可达0.38mg/mL蚕蛹匀浆上清液，将蚕蛹冻干后检测蚕蛹粉中rhLF的相对含量约为1.2mg/g。以E.coliTG1菌种为对象进行体外抑菌活性研究，发现rhLF蚕蛹粉能够抑制其生长甚至将其杀死，表明rhLF具有良好的抑菌活性。为了初步评价rhLF蚕蛹粉的安全性，以最大给药量(10g/kg)灌胃小鼠进行急性毒性试验研究，观察期内小鼠未表现出明显的毒性反应，各主要脏器未见明显异常，说明口服rhLF蚕蛹粉对小鼠的毒性极低。
　　在确定了rhLF蚕蛹粉的生物学活性和安全性后，考察其对小鼠急性UC的治疗作用。通过5％DSS诱导建立小鼠急性UC模型，分别以rhLF蚕蛹粉高、中、低(5、2.5、1.25g/kg)三个剂量给以灌胃，并以柳氮磺胺吡啶(SASP)和正常蚕蛹粉分别作为阳性和阴性对照，发现rhLF蚕蛹粉能明显减轻小鼠的炎症反应和结肠的炎症损伤，降低DAI分数和MPO、OPN的含量，说明rhLF蚕蛹粉对小鼠急性UC具有一定的治疗作用。为了进一步探究rhLF蚕蛹粉的作用机制，ELISA检测小鼠血清中IL-1α、IL-4、IL-6、IL-10细胞因子的含量，发现经rhLF蚕蛹粉治疗后，血清中促炎细胞因子IL-1α、IL-6水平显著下降，抗炎细胞因子IL-4、IL-10水平显著上升，推测rhLF蚕蛹粉主要是通过调节细胞因子网络平衡来促进结肠组织的炎症恢复，达到治疗UC的目的。
　　本研究在蚕蛹中成功表达了具有生物学活性的rhLF，初步探究了rhLF蚕蛹粉对小鼠急性UC模型的治疗作用及作用机制，为今后rhLF蚕蛹粉的临床研究及药物开发奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 引言

1．1 乳铁蛋白的研究现状

1．1．1 乳铁蛋白的结构特性及理化性质

1．1．2 乳铁蛋白的生物学活性与功能

1．1．3 乳铁蛋白的异源表达

1．1．4 乳铁蛋白的开发和应用前景

1．2 溃疡性结肠炎的研究现状

1．2．1 溃疡性结肠炎的概况

1．2．2 溃疡性结肠炎的治疗

1．2．3 溃疡性结肠炎动物模型建立方法的比较

1．3 家蚕生物反应器的优势

1．4 实验方案设计

1．4．1 研究目的和意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 实验流程图

第二章 重组杆状病毒的活化及滴度测定

2．1 材料、试剂与仪器设备

2．1．1 材料

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 主要试剂的配制

2．2 方法

2．2．1 家蚕BmN细胞的培养

2．2．2 重组杆状病毒vBm-hLF感染家蚕BmN细胞

2．2．3 重组病毒vBm-hLF基因组的提取及PCR鉴定

2．2．4 实时荧光定量PCR法测定重组病毒滴度

2．2．5 rhLF蛋白在BmN细胞中的表达及鉴定

2．3 结果

2．3．1 重组病毒基因组的PCR鉴定

2．3．2 重组病毒滴度的测定

2．3．3 rhLF在BmN细胞内的表达鉴定

2．4 讨论

第三章 rhLF在蚕蛹中的表达及体外抑菌活性检测

3．1 材料、试剂及仪器设备

3．1．1 材料

3．1．2 试剂及仪器

3．1．3 主要试剂的配制

3．2 方法

3．2．1 重组病毒vBm-hLF感染家蚕蛹

3．2．2 ELISA法检测蚕蛹中rhLF的相对表达量

3．2．3 蚕蛹粉的制备及rhLF的检测

3．2．4 蚕蛹粉中rhLF的含量检测

3．2．5 rhLF蚕蛹粉的体外抑菌活性检测

3．3 结果

3．3．1 不同时间rhLF在家蚕蛹中的相对表达量

3．3．2 rhLF在家蚕蛹中的SDS-PAGE和Western blotting鉴定

3．3．3 体外抑菌活性检测

3．4 讨论

第四章 rhLF蚕蛹粉的急性毒性试验

4．1 实验动物

4．2 试剂的配制

4．3 方法

4．3．1 半数致死量(LD50)预实验

4．3．1 最大给药量试验

4．4 结果

4．5 讨论

第五章 rhLF蚕蛹粉对小鼠急性溃疡性结肠炎的治疗作用

5．1 实验动物

5．2 试剂

5．3 试剂的配制

5．4 方法

5．4．1 动物分组及剂量设定

5．4．2 UC模型的建立及给药治疗

5．4．3 疾病活动指数评分

5．4．4 标本的采集与处理

5．4．5 生化指标的检测

5．4．6 结肠组织病理切片的制作

5．5 结果

5．5．1 造模及小鼠DAI评分

5．5．2 小鼠结肠大体观察及长度变化

5．5．3 生化指标的检测结果

5．5．4 结肠组织切片观察

5．6 讨论

第六章 rhLF蚕蛹粉对急性期UC小鼠血清细胞因子的影响

6．1 材料与试剂

6．1．1 材料

6．1．2 试剂

6．2 方法

6．2．1 实验原理

6．2．2 血清IL-1α的检测

6．2．3 血清IL-4的检测

6．2．4 血清IL-6的检测

6．2．5 血清IL-10的检测

6．2．6 数据处理

6．3 结果

6．4 讨论

结论

参考文献

致谢