DNA shuffling建库筛选靶向感染鼻咽癌细胞的腺相关病毒

摘要

随着科学技术的发展，基因治疗逐渐成为今后治疗肿瘤的趋势。所谓肿瘤基因治疗是指通过各种载体将治疗目的基因用基因转移技术导入肿瘤或其他体细胞内，纠正过度活化或补偿缺陷基因，从而使靶细胞获得新的特性，使其对肿瘤起杀伤和抑制作用以达到治疗肿瘤的目的。在这个过程中，通过相应的载体将目的基因导入靶细胞是关键步骤，因此，寻找一个理想的基因载体成为肿瘤基因治疗的一个重要环节。
　　 腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科。多年来AAV由于其显著的特征成为一种很有潜力的病毒载体:1）没有发现任何人类疾病与AAV有关;2)AAV具有对分裂期细胞和非分裂期细胞都有感染的能力;3）其在体内的宿主范围比较广，如心脏，肌肉，肝脏等;另外，AAV能介导目的基因在靶细胞中长期表达。但是在AAV作为载体使用时，由于其宿主广而引起非特异的感染以及对携带的目的基因非特异的表达会引起脱靶甚至免疫反应，使其在基因治疗中受到了限制。因此提高AAV的靶向性和感染性是更好发挥AAV载体功能的关键。
　　 AAV的靶向性是由AAV衣壳决定的，AAV衣壳上含有入侵靶细胞时产生免疫反应的抗原决定簇，且衣壳是AAV侵入细胞时与宿主表面直接接触的位点，因此通过适当的方法改变AAV衣壳能获得对靶细胞有高效靶向感染性的新型AAV。目前已经发现超过100多种的AAV血清型，这些不同血清型AAV有很高的同源性，其中对AAV2的研究最为彻底。基于这个原因，本课题是以实验室保存的原始型AAV2/1、AAV2/2、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9为基础，以AAV2rep基因为通用rep基因，为后面设计通用引物提供基础。
　　 本课题利用DNAshuffling技术对AAV衣壳序列进行改组，构建嵌合AAV病毒文库，然后用其靶向筛选鼻咽癌细胞。其具体步骤如下:
　　 (1)构建pAdB-rc载体分子克隆文库
　　 先通过巢式PCR得到的AAV衣壳基因，即cap序列片段，将其割胶回收。再用DNaseⅠ进行酶切，割胶回收200-1000bp片段。然后将酶切片段用各种酶进行无引物PCR重组，再用带酶切位点的引物在各种酶条件下对重组序列进行PCR扩增得到大量的嵌合型cap序列片段。通过对比各种条件下的DNAshuffling结果，筛选出最好的DNAshuffling条件，再反复使用最优条件重复DNAshuffling来扩增嵌合型cap序列片段。接着将获得的嵌合型cap序列和实验室保存的pAdBⅡ载体通过酶切连接在一起构建pAdB-rc载体，将其转化到SURE菌感受态中构建pAdB-rc载体分子克隆文库。
　　 (2)嵌合AAV的筛选
　　 在克隆库的基础上，摇菌抽提质粒，用磷酸钙转染法在HEK293细胞中包装病毒，获得嵌合AAV病毒文库。然后将得到的嵌合型AAV浓缩，测滴度，并按一定MOI值加入到鼻咽癌细胞CNE-3中。通过四轮的筛选，得到靶向感染CNE-3细胞的嵌合型AAV。
　　 (3)嵌合AAV靶向性和感染性的检测
　　 将嵌合型AAV通过PCR分离出来，酶切连接回pAdB载体中，测序，通过分析测序结果，选择比例高的克隆，命名为cAAV。得到cAAV后，我们将其与带有EGFP基因的pAAV通过双质粒磷酸钙转染法在HEK293中包装成重组AAV，命名为cAAV-EGFP。并且将各种原始型AAV也与pAAV同样包装重组成AAV1-EGFP、AAV2-EGFP、AAV3-EGFP、AAV4-EGFP、AAV7-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP。再将这8种重组AAV分别感染CNE-3细胞，通过观察绿色荧光的表达，验证cAAV-EGFP对CNE-3细胞的感染性。同时，将8种重组AAV感染其他癌细胞，以此观察其感染效率，验证cAAV-EGFP对CNE-3细胞具有靶向性。
　　 本研究通过对DNAshuffling多方面的探索，发现用PfuDNA聚合酶进行无引物PCR重组后，再用KOD-Plus-DNA聚合酶进行扩增，得到的结果最好。然后通过磷酸钙法进行病毒包装初步得到嵌合型AAV病毒文库，并用其靶向筛选CNE-3鼻咽癌细胞。通过四轮的筛选，初步得到了嵌合型AAV(cAAV)。由测序结果得到，cAAV是由AAV1、AAV2、AAV3、AAV8组成的嵌合体。最后本研究通过对cAAV感染性和靶向性的检测，发现与原始型相比较，嵌合型对CNE-3细胞的感染效率更高，以及对CNE-3细胞的靶向性比较专一。这为cAAV在体内的进一步研究打下基础，同时也为合理构建AAV嵌合文库以及靶向筛选治疗基因做出了基础性的探索。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1 前沿

2 基因治疗的病毒载体简介

2．1 逆转录病毒

2．2 慢病毒

2．3 腺病毒

2．4 单纯疱疹病毒载体

2．5 腺相关病毒载体

3 腺相关病毒的生物学简介

4 DNA shuffling在AAV载体改组的原理及应用发展

5 鼻咽癌治疗的现状及发展

6 AAV载体在肿瘤基因治疗中的应用

6．1 AAV介导的抗血管生基因治疗

6．2 AAV介导的自杀基因治疗

6．3 AAV介导的免疫基因治疗

6．4 AAV介导的联合治疗

7 本科题的研究内容及创新点

7．1 本课题的研究内容

7．2 本课题的创新点

第二章 pARC载体克隆库的构建

1．前言

2 实验器材

2．1 主要实验材料

2．2 主要实验仪器

2．3 主要实验试剂

2．4 主要试剂的配置方法

2．5 引物合成

3 实验方法

3．1 AAV1-9 cap片段序列的获得

3．2 AAV衣壳的DnaseⅠ酶切

3．3 AAV衣壳的DNA shuffling技术探索

3．4 AAV衣壳DNA shuffling产物回收

3．5 构建pAdB-rc克隆库

4 结果

4．1 各原始型AAV的cap片段序列电泳结果

4．2 原始型AAV cap片段序列经DnaseⅠ酶切后的电泳结果

4．3 AAV衣壳的DNA shuffling技术探索结果

4．4 重组后目的片段和非特异性拖带电泳结果

4．5 构建pAdB-rc克隆库

5 讨论

第三章 细胞培养及嵌合AAV的筛选

1 前言

2 实验器材

2．1 实验所需材料及试剂

2．2 实验所需仪器

2．3 主要试剂的配制

3 实验方法

3．1 HEK293细胞复苏和传代

3．2 CNE-3细胞的复苏和传代

3．3 pAdB-rc质粒转染HEK293细胞

3．4 测浓缩嵌合AAV的滴度

3．5 嵌合AAV的筛选

3．6 PCR检测筛选到的嵌合AAV(cAAV)

4 实验结果

4．1 嵌合型AAV病毒文库基因组滴度检测的结果

4．2 确定Ad35-EGFP感染时间和MOI值的荧光结果

4．3 嵌合AAV文库筛选CNE-3鼻咽癌细胞时的荧光结果

4．4 四轮筛选cAAV的PCR检测

5 讨论

第四章 cAAV感染活性的检测

1 前言

2 实验器材

2．1 实验所需材料

2．2 实验所需仪器

2．3 实验所需主要试剂

2．4 主要试剂的配制

3 实验方法

3．1 分离嵌合型AAV病毒

3．2 每种原始型AAV以及cpAdB-rc与pAAv-EGFP重组包装AAV-EGFP

3．3 重组病毒AAV-EGFP的RT-PCR检测

3．4 cAAV-EGFP感染活性的检测

3．5 cAAV-EGFP靶向性的检测

4 实验结果

4．1 cAAV病毒DNA和载体pAdBⅡ的酶切鉴定结果

4．2 cpAdB-rc克隆鉴结果

4．3 cAAV与qAAV-EGFP重组的荧光结果

4．4 cAAV测序结果

4．5 各种重组AAV病毒的RT-PCR检测

4．6 cAAV-EGFP感染性的检测

4．7 cAAV与qAAV-EGFP靶向性的检测

5、讨论

总结

参考文献

致谢