蛋白质的定向固定化:亲和作用和LB法

摘要

生物移植材料、生物传感器和生物电池等领域具有重要科研意义和应用价值，已经受到越来越多的关注。这些领域的研究和应用都会涉及到蛋白质和载体材料表面的接触和相互作用。如果不加控制，蛋白质在载体表面的分布是随机无序的，而且由于与载体的作用很容易导致蛋白质构象改变和失活。目前，蛋白质的可控吸附是蛋白质研究的一个重要方面，主要包括控制吸附蛋白质的取向、吸附量和保持其构象等方面，从而能够更好的发挥蛋白质的生物活性。
　　控制蛋白质吸附的方法主要有物理吸附法、化学固定法和生物亲和吸附法等。通常，一般的物理吸附法不能很好的控制蛋白质的吸附量和构象，也不能选择性的吸附某种蛋白质;化学固定法操作比较复杂，而且化学试剂容易使蛋白质变性和失活;生物亲和吸附法操作也比较复杂，但可以控制蛋白质的取向以及保持其生物活性，有些情况下还能重复使用。
　　本文采用生物亲和吸附法制备电化学传感器，首先将辣根过氧化物酶(HRP)的辅基(血红素，Hemin)和葡萄糖氧化酶(GOx)的辅基(黄素腺嘌呤二核苷酸，FAD)固定在功能化的氧化石墨烯上，制备改性的辅基，然后将去辅基的酶与之重组得到辅基改性的酶，制备酶电极并检测其电化学活性。发现通过氧化石墨烯和五聚苯胺改性的辣根过氧化物酶比未改性酶的电化学活性提高了将近4倍。将改性的辅基还原，测得电流值随还原程度增加而增大。最大值可以达到280μA。通过氧化石墨烯改性的葡萄糖氧化酶比未改性酶的电化学活性提高了将近3倍多。将改性的辅基还原，测得的电流值随还原程度的增加而增大，测得的最大值可以达到220μA。
　　采用LB法将酪氨酸酶定向固定在载体表面。首先合成含酪氨酸酶竞争性抑制剂的表面活性剂，然后将此分子与酶活性中心形成亲和作用后制备LB膜;并将水溶性聚苯胺也与其混合后制备酶电极检测其电化学活性。发现LB法比普通吸附法固定化的蛋白质活性高;另外，用酪氨酸酶的竞争性抑制剂与酶混合后制备的LB膜比没有抑制剂时的活性有提高。加入聚苯胺后，测得的酪氨酸酶LB膜的电化学活性有进一步提高。降低了氧化电压，减小过电势，也提高了催化电流，提高传感器的灵敏度。
　　制备了一系列不同比例的纤维蛋白（原）（HFg(HF)）与牛血清白蛋白(BSA)的二元蛋白质LB膜，然后用于研究蛋白质吸附层对血小板粘附行为的影响。发现普通吸附法固定化的HFg易转变为HF。而LB法可以保持HFg的构象不变。普通吸附法固定的一系列比例的HFg/BSA吸附层都会引起血小板的粘附和变形，并形成网状结构。用LB法制备的HFg/BSA吸附层很难引起血小板的粘附，而且不易引起变形;对于用LB法制备的HF/BSA吸附层，当HF的比例为25％时，血小板几乎不粘附，且保持球形;当HF的含量增加至49％，血小板粘附扩展，并开始长出伪足。原因可能是HF分子的αC链上有与血小板的整合素作用的多肽链或者是αC链之间形成网状结构后，有利于血小板与HF作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 载体性质对蛋白质吸附行为的影响

1．1．1 表面功能基团的影响

1．1．2 接枝聚合物链的影响

1．2 蛋白质的可控吸附及表征

1．2．1 蛋白质的可控吸附

1．2．2 吸附蛋白质的表征

1．2．2．吸附蛋白质取向的表征

1．3 LB法控制蛋白质的吸附

1．3．1 蛋白质LB膜的种类

1．3．2 制备蛋白质LB膜的方法

1．3．3 亚相的影响

1．3．4 载体的影响

1．4 电化学生物传感器

1．4．1 电化学生物传感器的发展

1．4．2 电化学传感器中酶分子的固定化方法

1．5 课题的意义与提出

第二章 基于辅基亲和作用的酶固定及其电化学行为

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料与试剂

2．2．2 羧基化的氧化石墨烯的制备

2．2．3 氨基封端苯胺五聚体的合成

2．2．4 氧化石墨烯-五聚苯胺-氯化血红素的制备

2．2．5 去辅基辣根过氧化物酶(apo-HRP)的制备

2．2．6 氧化石墨烯-黄素腺嘌呤二核苷酸的制备

2．2．7 去辅基葡萄糖氧化酶(apo-GOx)的制备

2．2．8 改性氧化石墨烯的制备

2．2．9 改性辣根过氧化物酶(modified-HRP)的制备

2．2．10 改性的葡萄糖氧化酶(modified-GOx)的制备

2．2．11 辣根过氧化物酶电极的制备及电化学行为

2．2．12 葡萄糖氧化酶电极的制备及电化学行为

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 氧化石墨的制备与表征

2．3．2 五聚苯胺及五聚苯胺-血红素的合成与表征

2．3．3 酶去辅基的表征

2．3．4 改性氧化石墨烯的红外表征

2．3．5 还原对酶电极的影响

2．4 本章小结

第三章 LB法定向固定化酪氨酸酶及其活性测定

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验材料与试剂

3．2．2 酪氨酸酶的分离及水溶性聚苯胺的合成

3．2．3 酪氨酸酶LB膜的制备

3．3 结果与讨论

3．3．1 没食子酸十八醇酯的红外表征

3．3．2 没食子酸十八醇酯对酪氨酸酶活性的抑制效果

3．3．3 没食子酸酸十八醇酯的表面压面积曲线

3．3．4 普通吸附法与LB法的活性对比

3．3．5 固定化的酪氨酸酶电化学活性测定

3．4 本章小结

第四章 Langmuir-Blodgett法控制蛋白质吸附及血小板粘附行为

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料与试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 蛋白质膜的制备及表征

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 HFg(HF)和BSA在载体表面的吸附量

4．3．2 HFg(HF)在载体表面的构象

2．3．3 血小板粘附及形貌

4．4 小结

第五章 总结与展望

参考文献

攻读硕士期间发表论文和待发表论文

致谢