大量扩增抗原特异性活化T细胞的方法研究

摘要

癌症的高发率和年轻化的趋势已经越来越威胁到人类的健康。目前，已有的治疗方法包括:外科手术切除法，放疗，化疗等等。但是目前这些方法都不能完全治愈癌症，然而，过继性免疫细胞治疗为癌症的治疗带来了新的希望。与传统的肿瘤治疗方法不同，大多数免疫治疗在消除肿瘤的过程中显示出重要的作用，而且可以通过诱导免疫记忆来建立肿瘤与机体之间新的平衡，从根本上治愈肿瘤。免疫细胞治疗技术与其他抗肿瘤策略如手术、放化疗的联合应用已经证实优于单一的治疗方案，极大拓宽了细胞免疫治疗。
　　过继性免疫细胞治疗是指通过输入自身或同种异体的肿瘤杀伤细胞来治疗肿瘤的方法。它不仅可以纠正细胞免疫功能的低下，促进宿主抗肿瘤免疫的功能，还可以直接发挥抗肿瘤的作用。其中细胞毒性T细胞的过继治疗有着特殊的优越性。细胞毒性T细胞的过继治疗是实体肿瘤，尤其是肿瘤相关抗原比较明确的恶性黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究热点。特异性CTLs（细胞毒性T细胞）的产生是通过将肿瘤抗原负载成熟的DC（树突状细胞）刺激T细胞从而获得单一抗原的特异性CTLs克隆。这种CTL能识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，经过大量的扩增就能应用于临床治疗。这种治疗方法相比其他的治疗方法具有易获得、可操作性强，靶向性好，安全性高等特点。
　　但是，过继性T细胞转移还面临很多的问题:DC的成熟程度低，免疫耐受，特异性活化T细胞的数量不足等等。由于DC扩增具有很大的难度，所以这也间接限制了特异性活化T细胞的数量。本文主要通过以下三个步骤建立扩增抗原特异性T细胞的方法:
　　(1)用Ficoll密度梯度离心的方法从癌症病人外周血中分离单核细胞后贴壁培养并将悬浮的T淋巴细胞冻存以备后续试验之用。培养单核细胞时加入细胞因子FLT3L，GM-CSF，IL-4诱导分化，在培养第6天以MOI值为5加入Ad5-MUP53负载抗原。最后加入细胞因子TNF-α，LPS，PGE-2诱导DC成熟。
　　(2)将培养成熟的DC与相同人的初始T细胞以1∶10的比例共培养。在之后的培养中连续加入DC刺激T细胞形成抗原特异性的活化T细胞。培养细胞过程中每两天加入IL-2，IL-7，IL-15促进细胞的生长。
　　(3)将共培养后的T细胞转入包被了CD3，CD28抗体的小培养瓶中培养，并进行大量扩增。培养细胞过程中每两天加入IL-2，IL-7，IL-15促进细胞的生长。
　　本文通过以上三个步骤建立了能大量扩增抗原特异性活化T细胞的方法，最多能将细胞扩增至30倍左右。具体结果如下:
　　(1)我们发现扩增出的细胞中CD3，CD8的阳性比例较高，说明培养出的细胞中T淋巴细胞的比例很高，而且CD8+的特异性活化T细胞的占有很高的比例。
　　(2)流式检测还发现培养的细胞中CD4+CD25-的细胞比例很低，这说明Treg细胞的比例很低。Treg细胞是一种维持体内免疫平衡，与免疫耐受机制相关的细胞。所以较低的Treg细胞比例有利于培养的细胞行使免疫杀伤的功能，并且能够增强免疫反应。
　　(3)通过本文方法培养的细胞中能分泌大量的IFN-γ的细胞占较大比例，并且每个分泌IFN-γ细胞的平均分泌量比阳性对照要多。IFN-γ是一种广谱的抗病毒剂，虽然它并不直接杀伤或抑制病毒，但是它能够通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制;同时还能增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节的作用，并增强能抗病毒能力。所以大量的IFN-γ对于免疫细胞发挥抗肿瘤的免疫反应有重要的临床意义。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 癌症治疗方法简介

1．2．1 癌症的手术切除法

1．2．2 癌症的化学治疗法

1．2．3 癌症的免疫治疗法

1．3 T细胞的分化，活化及凋亡

1．3．1 T细胞的分化

1．3．2 T细胞的活化

1．3．3 活化T细胞的凋亡

1．4 本课题的研究内容及创新点

1．4．1 本课题的研究内容

1．4．2 本课题的创新点

第二章 携带MUP53基因的腺病毒的构建

2．1 前言

2．2 实验器材

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 PDC659-MUP53-PPE3载体构建

2．3．2 质粒的大量制备

2．3．3 病毒重组，扩增和纯化

2．4 实验结果

2．4．1 用于质粒PDC659-MUP53-PPE3构建的目的片段的电泳结果

2．4．2 重组腺病毒的鉴定

2．4．3 病毒滴度的检测

2．5 结果分析

第三章 诱导单核细胞成为成熟的树突状细胞

3．1 前言

3．2 实验器材

3．2．1 主要实验材料

3．2．2 主要实验器材

3．2．3 主要实验试剂

3．3 实验方法

3．3．1 从外周血中分离单核细胞

3．3．2 诱导单核细胞成为成熟的树突状细胞(DC)

3．3．3 流式表型检测

3．4 实验结果

3．5 结果分析

第四章 成熟的树突状细胞(DC)与初始T细胞共培养

4．1 前言

4．2 实验器材

4．2．1 主要实验材料

4．2．2 主要实验

4．2．3 主要实验试剂

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．4．1 流式检测细胞CD3和CD8的表型

4．4．2 流式检测Treg细胞(调节性T细胞)比例

4．4．3 Elispot检测细胞IFN-γ的分泌

4．5 结果分析

第五章 特异性T淋巴细胞的大量扩增

5．1 前言

5．2 实验器材

5．2．1 主要实验材料

5．2．2 主要实验

5．2．3 主要实验试剂

5．3 实验方法

5．4 实验结果

5．4．1 细胞因子诱导的特异性T细胞扩增曲线

5．4．2 流式检测细胞CD3，CD8的表型

5．4．3 流式检测Treg细胞(调节性T细胞)比例

5．4．4 流式检测NK细胞(自然杀伤细胞)比例

5．4．5 Elispot检测IFN-γ的分泌

5．5 结果分析

结论

参考文献

致谢