地衣芽孢杆菌脂肪酶发酵条件优化及固定化研究

摘要

脂肪酶(EC3.1.1.3)是可以水解长链甘油三酯的水解酶家族成员，它是生物催化剂的工业应用领域中非常重要的一员。随着脂肪酶的作用机制和应用范围被不断发现和扩展，微生物脂肪酶已经被广泛应用到洗涤剂、香料、能源、食品工业、化学合成、化妆品、生物传感器、生物降解、酯类及氨基酸衍生产品等诸多领域。
　　绝大多数工业应用的酶都是通过微生物大规模发酵来获取的，随着工业应用对脂肪酶需求量的不断增大，除了通过寻找新型脂肪酶生产菌株及基因工程改造已有菌株外，利用科学合理的试验设计方法对发酵产酶条件进行优化提高脂肪酶产量或者利用固定化酶来提高酶的利用率也是十分重要的途径，本研究正是在这样的背景下提出的。
　　在本实验室已构建地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）胞外脂肪酶Bli02525重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）蛋白酶缺失型菌株WB700的基础上，本研究以该地衣芽孢杆菌胞外脂肪酶表达菌株为研究对象，利用响应面设计方法(Response Surface Methodology，RSM)对其产酶条件进行优化，利用氨基型载体ZH-HA，对脂肪酶进行固定化并研究了固定化前后脂肪酶的基本性质。
　　通过RSM进行优化后得到了最佳培养基成分的配比，并利用该最佳培养基进行了10L发酵中试放大试验，在发酵进行到30h时发酵上清液总酶活力达到46 U/mL，相比优化前摇瓶培养时的17.3 U/mL提高了2.6倍。利用氨基型载体ZH-HA进行固定化后，固定化酶颗粒最适反应表观pH在10.0左右，最适反应温度为45℃，该固定化酶颗粒工作稳定性很高，在重复使用15个批次后，酶活力还能保留90％以上，大大提高了酶的重复利用率。本研究结果将为脂肪酶的工业生产提供重要理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 脂肪酶的研究及其应用

1．1．1 脂肪酶

1．1．2 脂肪酶来源

1．1．3 微生物脂肪酶的研究

1．1．4 脂肪酶结构及作用机制

1．1．5 脂肪酶的应用

1．2 枯草芽孢杆菌表达系统

1．2．1 枯草芽孢杆菌

1．2．2 枯草芽孢杆菌蛋白分泌机制

1．2．3 枯草杆菌表达系统的优势与不足

1．3 响应面方法

1．3．1 RSM的应用研究

1．4 固定化酶

1．4．1 固定化方法

1．4．2 固定化脂肪酶的研究

第二章 利用响应面方法优化重组地衣芽孢杆菌脂肪酶的表达

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验菌株及载体

2．2．2 实验试剂

2．2．3 仪器设备

2．2．4 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 实验参数的测定方法

2．3．2 表达培养

2．3．3 最佳碳源的确定

2．3．4 最佳氮源的确定

2．3．5 单因素实验

2．3．6 PB实验

2．3．7 响应面方法优化实验

2．3．8 发酵中试放大实验

2．3．9 SDS-PAGE实验

2．4 实验结果

2．4．1 表达培养结果

2．4．2 最佳碳源

2．4．3 最佳氮源

2．4．4 单因素实验结果

2．4．5 PB实验结果

2．4．6 CCD实验结果

2．4．7 发酵中试放大实验结果

2．5 讨论

第三章 利用氨基型载体固定脂肪酶

3．1 引言

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 酶的固定化

3．3．2 酶活力测定

3．3．3 最佳固定化反应时间

3．3．4 游离酶与固定化酶最适反应表观pH对比

3．3．5 游离酶与固定化酶最适反应温度对比

3．3．6 固定化酶工作稳定性

3．4 实验结果

3．4．1 最佳固定化反应时间

3．4．2 游离酶与固定化酶最适反应表观pH值对比

3．4．3 游离酶与固定化酶最适反应温度对比

3．4．4 固定化酶稳定性

3．5 讨论

第四章 总结与展望

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢