鲨鱼TBC1D15蛋白功能的初步研究

摘要

糖尿病是由基因和环境因素相互作用而引起的糖代谢紊乱疾病，特点是胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足而引起血糖过高。糖代谢的混乱能引发很多种并发症，是肿瘤、心血管病变之后第三大严重影响人类康健的慢性、非传染疾病。早期研究表明从条纹斑竹鲨再生肝脏分离的鲨肝活性肽(APSL)能抗脂质过氧化，清除自由基，保护、修复受损肝脏和胰岛β细胞。药理药效研究表明将家蚕表达的CTB-APSL融合蛋白制备口服剂型，灌胃给与2型糖尿病模型小鼠，能有效保护胰岛细胞，修复其受损细胞，促使其增加胰岛素分泌达到降血糖作用。随着条纹斑竹鲨再生肝脏cDNA文库高通量测序完成，通过生物信息学分析，发现APSL存在shark TBC1D15序列的N端，即APSL全蛋白是鲨鱼中TBC1D15家族的新成员，但未开展其功能研究。
　　本实验根据已报道的TBC1D15蛋白功能，开展了APSL全蛋白的功能验证，并检测APSL全蛋白Rab-GAP的特异性。前期生物信息学分析表明APSL全蛋白的基因序列包含具有GAP活性的domain结构域，结构域中有TBC家族典型的六个motifs A-F，与人TBCdomain同源性高达91％。有研究表明蛋白TBC1D15对Rab7/Rab11蛋白具有GAP活性。
　　因此，利用大肠杆菌表达系统表达APSL全蛋白和融合蛋白MBP-Rab7-WT（野生型）、MBP-Rab7-Q67L（激活型）、MBP-Rab7-T22N（抑制型），利用His pull down实验检测APSL全蛋白与融合蛋白Rab7的相互作用，结果表明，APSL全蛋白能结合Rab7，且与不同的形态Rab7蛋白结合量不一样，提示APSL全蛋白具有Rab-GAP活性。
　　此外，为了进一步研究APSL全蛋白对不同Rab蛋白的GAP活性特异性，分别构建重组质粒pETduet-His-sumo-Rab4/Rab5/Rab8/Rab11，同时重新构建重组质粒pETduet-His-sumo-Rab7-WT，分别在大肠杆菌系统中诱导表达，并纯化融合蛋白His-sumo-Rab4/Rab5/Rab7/Rab8/Rab11。通过分析Rab蛋白水解GTP为GDP时Pi的释放量，间接反应出APSL全蛋白对Rab蛋白的GAP活性的特异性。实验结果表明，APSL全蛋白对Rab蛋白具有GAP活性特异性，且APSL全蛋白对Rab11蛋白的活性最强，对Rab4蛋白基本没有活性。根据其序列结构和功能特点可推测出，APSL全蛋白是在鲨鱼中发现的TBC1D15蛋白，命名为shark TBC1D15蛋白，其属于TBC1D15家族。
　　为了研究shark TBC1D15蛋白的表达和调控，结合本实验室的研究平台，开展了miRNA对其调控的研究，以进一步探索shark TBC1D15蛋白可能具有的功能。采用双荧光素酶报告基因法研究miRNA对shark TBC1D15靶基因的调控。目前已筛选出一个可以调控shark TBC1D15基因的miRNA。
　　本课题通过TBC1D15家族所具有的Rab-GAP功能，验证了APSL全长蛋白是TBC1D15家族的新成员，这是shark TBC1D15的首次报道，增添了TBC1D15家族的丰富性。miRNA与shark TBC1D15基因相互作用的研究为探索APSL降血糖的机制及特定miRNA对糖代谢的调控提供了新的思路。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语

第一章 绪论

1．糖尿病概况及危害

2．鲨肝活性肽的研究进展

3．TBC家族的研究进展

3．1 TBC蛋白家族

3．2 TBC1D15的研究进展

4．microRNA的研究和生物信息学分析

4．1 microRNA的研究

4．2 microRNA的调控作用

5．实验方案设计

5．1 实验的目的与意义

5．2 研究的内容

5．3 实验流程图

第二章 APSL全蛋白对Rab7的体外GAP活性分析

1．材料与试剂

1．1 材料

1．2 试剂

2．方法

2．1．CaCl2法制备E．coli BL21感受态细胞

2．2 质粒转化

2．3 APSL全蛋白原核表达纯化

2．4 融合蛋白MBP-Rab7-WT／Q67L／T22N基因的原核表达及产物纯化

2．5 His-pull down

3．实验结果

3．1 APSL全蛋白表达纯化

3．2 融合蛋白MBP-Rab7-WT／Q67L／T22N表达纯化

3．3 APSL全蛋白对Rab7的体外GAP活性分析(His pull down)

4．讨论

第三章 APSL全蛋白体外GAP活性特异性分析

1 材料与试剂

1．1 材料与试剂

1．2 主要试剂的配制

1．3 Rab4／Rab5／Rab8／Rab11基因的获得

2 方法

2．1 目的基因和载体质粒双酶切

2．2 目的基因和载体质粒连接反应

2．3 CaCl2法制备E．coli TG1感受态细胞

2．4 连接产物转化

2．5 重组质粒的提取及鉴定

2．6 融合蛋白His-sumo-Rab4／Rab5／Rab7-WT／Rab8／Rab11表达纯化

2．7 Bradford法测蛋白浓度

2．8 APSL全蛋白与多种Rab蛋白体外GAP活性特异性分析

3 实验结果

3．1 重组质粒pETduet-His-sumo-Rab4／Rab5／Rab7／Rab8／Rab11菌液PCR鉴定

3．2 融合蛋白His-sumo-Rab4／Rab5／Rab7／Rab8／Rab11表达纯化

3．3 APSL全蛋白的Rab-GAP特异性分析

4 讨论

第四章 靶定shark TBC1D15 3’UTR的microRNA筛选及鉴定

1 材料与试剂

2 方法

2．1 shark TBC1D15 3’UTR的获得

2．2 靶定miRNA的筛选

2．3 截取200 bp的3’UTR序列送到公司合成

2．4 双酶切及连接反应

2．5 连接产物的转化及重组质粒鉴定

2．6 筛选能靶定到截断UTR的miRNA并合成minics

2．7 细胞冻存

2．8 细胞复苏

2．9 质粒的提取

2．10 细胞转染

2．11 双荧光素酶报告基因的检测

3．实验结果

3．1 筛选靶定到shark TBC1D15 3’UTR的miRNA

3．2 pUC57-3’UTR载体双酶切

3．3 3’UTR重组质粒的鉴定

3．4 筛选出靶定200 bp UTR的miRNA及合成minics

3．5 双荧光素酶报告法验证靶基因3’UTR的microRNA

4 讨论

第五章 融合蛋白shark TBC1D15制备多克隆抗体

1 材料与试剂

1．1 材料与试剂

1．2 主要试剂的配制

2 方法

2．1 抗原的制备

2．2 免疫动物及多抗的制备

2．3 血清多抗效价的测定

2．4 Western Blotting检测

3 实验结果

3．1 血清多抗效价检测

3．2 血清多抗Western Blotting检测

4 讨论

小结

参考文献

致谢