基于辅基法的多酶体系定向共固定化研究

摘要

随着多酶级联催化的广泛应用，多酶体系的共固定化也越来越受到关注。将多种酶在载体表面进行级联结合，充分地利用不同酶种的催化特性，提高中间产物的运转浓度，既能扩展酶催化的应用范围，又可以提升多酶体系的整体反应效率，在很大程度上克服了单酶反应体系单一催化的局限性。而酶定向固定化是将酶蛋白有序地结合到载体的特定位点，能最大限度地保持酶的天然构象，有助于保护酶催化的功能，具有非常重要的研究应用价值。
　　葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）和胆固醇氧化酶（Cholesterol oxidase，ChOx），均以黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavine adenine dinucleotide，FAD）为催化反应活性中心。GOD和ChOx分别可以催化葡萄糖（Glucose）和胆固醇（Cholesterol）生成对应产物和过氧化氢（H2O2）。H2O2不仅会对酶造成损伤，还作为中间产物发生累积从而抑制反应的持续进行。辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP），以血红素（Hemin）为活性中心，可消耗H2O2，促进反应正向进行。因此GOD和ChOx可以与HRP分别构建GOD-HRP以及ChOx-HRP多酶级联催化体系。这三种氧化还原酶，均存在辅基—即活性中心，因此可借助辅基-脱辅酶亲和作用构建定向共固定化多酶体系。该方法能实现高度的定向化，且不涉及对酶分子的修饰改性，对酶损伤较小，具有广泛的应用前景。
　　本文采用辅基定向固定化的方法制备多酶级联催化体系：首先借助导电聚合物—聚苯胺（Polyaniline，PANI）在氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）表面构建了两臂不对称的“Y”型支架，分别将葡萄糖氧化酶（GOD）的辅基（黄素腺嘌呤二核苷酸，FAD）和辣根过氧化物酶（HRP）的辅基（血红素，Hemin）固定在功能化的载体上，然后将脱辅基的酶与之重组，完成定向共固定化的GOD-HRP和ChOx-HRP多酶催化体系的构建。
　　研究发现，GOD-HRP多酶催化体系电化学活性比GOD单酶体系提高约3.6倍，底物反应的线性范围可达3~50mM；ChOx-HRP多酶催化体系电化学活性则比ChOx单酶体系提高约2.1倍，底物反应的线性范围可达3~80mM。定向共固定后的多酶体系热稳定性和耐酸碱性也有所增强。其中，GOD-HRP体系可在pH6.5~7.0保有较高的催化活力，最佳反应温度为35℃；ChOx-HRP体系适用于pH6.0~7.5环境，在35~45℃条件适用。
　　通过改变导电高分子的长度，即调控多酶级联催化过程中电子传导的路线，电化学活性也会发生变化。由于载体材料中使用了GO和PANI，其表面基团、缺陷以及共轭结构都将影响电流的输送。因此，研究了不同还原程度载体材料对多酶催化的影响，测得电流值随还原程度增加而增大。

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第一章 文献综述

1.1 多酶反应体系的主要类型

1.2 多酶体系共固定化技术

1.3 酶定向固定化技术

1.4 多酶体系定向固定化技术

1.5 课题的意义与主要研究内容

第二章 实验部分

2.1 实验试剂

2.2 定向共固定化载体的制备

2.3 定向共固定化载体的表征

2.4 脱辅酶（Apo-protein）的制备

2.5 脱辅酶浓度的测定

2.6 定向共固定化多酶体系的构建

2.7 酶定向固定化构象表征

2.8定向共固定化多酶体系酶学性质研究

2.9 载体材料性能对多酶体系活性的影响

第三章 定向共固定化多酶体系的构建

3.1定向共固定化载体的合成与表征

3.2脱辅酶的制备与表征

3.3 利用Bradford法测定脱辅酶浓度

3.4 定向固定化酶体系的构建

3.3 本章小结

第四章 定向共固定化多酶体系酶学性质研究

4.1 多酶体系催化行为研究

4.2 载体材料对多酶体系催化行为的影响

4.3 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

攻读学位期间研究成果

致谢