条纹斑竹鲨肝脏中GSTP1基因的miRNA调控及其相互作用蛋白的研究

摘要

肝脏再生是肝脏区别于其他脏器的显著特点，肝再生分子调控机理的研究也一直是肝脏研究领域的重点之一。目前，研究肝再生的模式生物一般为小鼠、大鼠或家兔，以海洋生物为研究对象的很少，对处于早期进化重要地位的软骨鱼类的研究未见报道。条纹斑竹鲨因其体积小、分布广、全年均可捕捞的特点常作为软骨鱼类的代表生物；同时条纹斑竹鲨肝脏约占内脏总体积的75％且具有免疫调节功能，所以我们选择以条纹斑竹鲨为模式生物进行肝再生的研究。
　　本研究通过对条纹斑竹鲨正常肝脏转录组和损伤肝脏转录组进行差异表达分析获得359个差异表达基因(DEGs)，其中包括142个下调基因，217个上调基因。然后通过差异基因GO富集分析、表达水平聚类分析和qRT-PCR验证，筛选出与肝再生相关且表达量显著差异的13个基因，其中10个基因（slc22a16,Slc39a4,Slc1a2,NR5A2,hoga1,ESR2,DIO1,Atp2a2,comp51558_c0,comp43528_c0）的表达量有明显上调，3个基因（GSTP1,comp44386_c0,comp60069_c3）的表达量明显下调，其中GSTP1基因是首次在条纹斑竹鲨肝脏转录组中发现的肝再生相关基因。
　　为了进一步研究GSTP1基因的miRNA调控，本文运用miRanda和Target Scan生物信息学软件在条纹斑竹鲨小RNA文库中筛选出3个与GSTP1具有靶向性的miRNAs，分别是chp-let-7a、chp-miR-143-3p_R+1_1ss21CA和chp-miR-143。随后利用双荧光素酶报告基因检测系统进行验证，初步证明chp-miR-143与GSTP1具有靶向性，这为后续研究肝再生调控机理提供依据。
　　本文通过构建原核表达载体pET-28a(+)-Shark GSTP1获得工程菌，经诱导表达得到重组蛋白His-Shark GSTP1，将纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。采取心脏取血的方式得到家兔全血，离心获得血清，并使用间接ELISA法测定效价，效价为1:51200。为降低血清中杂质的影响，我们采用蛋白A亲和层析的方法对兔血清进行纯化，并运用Western Blotting和MALDI-TOF MS在鲨鱼肝脏中首次验证了Shark GSTP1蛋白的存在。通过Co-IP方法从鲨鱼肝脏组织中的成功免疫沉淀出Shark GSTP1，并分离鉴定出与GSTP1互作的蛋白，大小约在70～100kDa，为以后研究GSTP1与其他蛋白的相互作用、参与信号通路的调控等提供依据。

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缩 略 语

第一章 绪论

1条纹斑竹鲨的研究概况

2 GSTP1的研究进展

3 miRNA的研究进展

4 转录组测序研究现状

第二章 实验方案

1 实验目的与意义

2 实验内容

3 实验流程图

第三章 鲨鱼肝脏中GSTP1的发现及鉴定

1 材料与试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 筛选调控GSTP1基因表达的miRNA

1 材料与试剂

2 方法

3 实验结果

4 讨论

第五章 GSTP1多克隆抗体的制备

1条纹斑竹鲨GSTP1基因的原核表达及产物纯化

2 重组Shark GSTP1多克隆抗体的制备

3 结果

4 讨论

第六章 Shark GSTP1 蛋白及其互作蛋白的鉴定

1试剂与仪器

2 方法

3 实验结果

4 讨论

结论

参考文献

致谢