丹参WRKY转录组分析及其在次生代谢物生物合成途径上的调控研究

摘要

丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)不仅是一种重要的大宗药用植物，还是一种研究药用植物的模式生物。因此，研究丹参次生代谢积累及其转录调控机制具有深远的意义及广阔的应用前景。WRKY是植物十大转录因子家族之一，广泛参与植物的生长、发育、生物或非生物胁迫响应等多种生理过程，最近研究发现该家族成员参与多种次生代谢物合成的调控，然而，有关丹参WRKY转录因子(SmWRKY)是否调控次生代谢物的合成却知之甚少。为此，本文采用生物信息学、分子生物学、植物化学等方法对SmWRKY家族成员的种类、结构特征、表达谱、以及其与次生代谢物积累的关联进行了分析。本研究既加深了人们对SmWRKY的认识，又为进一步探索SmWRKY的功能及其调控次生代谢产物合成的机制奠定了基础。
　　1.从丹参转录组库中共发现69条完整的SmWRKY的CDS序列，编码的氨基酸长度范围：129-706个，等电点(Pi)从4.76-9.9；分子质量(Mw)从15.2-36.2 kDa。SmWRKY的核心结构域不仅有常见的WRKYGQK，还有WRKYGEK、WRKYGKK。根据WRKY核心结构域的数目及锌指结构的类型，将WRKY分为3类(I类、II类、III类)，第II类又分为5个亚类(IIa类、IIb类、IIc类、IId类、IIe类)。其中在丹参中发现13个I类WRKY成员，46个II类WRKY成员，9个III类WRKY成员。为了进一步研究 SmWRKY结构特征，采用在线软件MEME5.0对SmWRKY氨基酸序列进行保守基序预测，结果表明所有的序列均含保守基序(Motif)Motif1和Motif2，说明此结构是SmWRKY的保守结构域。除此之外，不同类群的WRKY拥有特定的保守序列。这些结果说明SmWRKY家族基因趋异进化，含有较多的功能元件，也暗示该家族基因可能参与多种生理生化调控过程。
　　2.丹参毛状根培养18d时，添加茉莉酸甲酯(MeJA,100μmol·L-1)，在MeJA处理后第0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d、6d、9d采集样品，采用高效液相色谱(HPLC)对毛状根中丹酚酸类和丹参酮类部分成分含量进行检测。同时采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对SmWRKY、丹参酮类和丹酚酸类生物合成途径上关键酶基因的表达进行检测。根据基因表达构建heatmap图结果显示：大部分WRKY转录因子响应MeJA的诱导，表达模式大体分为3类：大部分上调表达，少部分下调表达，一部分在不同时间点上调或下调表达。同时也测定了在MeJA诱导下4种丹参酮类物质(二氢丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮)和3种酚酸类物质(迷迭香酸、丹酚酸B、咖啡酸)的含量，结果表明在MeJA的诱导下积累量也发生了显著的变化。除了丹参酮I外，其它6种次生代谢成分随时间的增加，积累量不断增加，从第6d开始，处理组的积累量显著高于对照组。而丹参酮 I的积累模式处理后第9d，实验组高于对照组。为了进一步研究SmWRKY与次生代谢物积累之间的关系，我们采用SPSS软件，双变量相关性分析―基因-次生代谢物之间的关系，推测SmWRKY36、SmWRKY45等7个WRKY可能参与酚酸类的生物合成；SmWRKY3、SmWRKY12等9个WRKY可能参与丹参酮类生物合成；SmWRKY1、SmWRKY7等7个WRKY可能参与这两类化合物的生物合成。
　　3.采用qRT-PCR测定不同花期SmWRKY和次生代谢关键酶基因的表达，构建heatmap图。结果显示：这74个基因表达谱可分为三类，第一类含有7个基因，在茎和叶组织中表达量较高，推测可能参与光合作用等生理活动；第二类包含的基因较多，表达模式多样化；这可能与WRKY功能多样化相关。第三类包含两个基因，SmWRKY47和SmWRKY60，在一些组织中不表达。同时发现同一类群的WRKY表达模式较为相似，如I、IIb、IIc、IIe和III类WRKY分别有61.％、37.5%、44.5%和66.6%、55.5%的成员在基因表达谱上聚在一起，这可能由于同一类的WRKY序列相似，导致表达模式相似。另外丹参酮合成途径上有50%的关键酶基因，丹酚酸合成途径上有42.8%的基因表达模式也相似。这可能与这些基因所行使的功能相似所造成。
　　4.从丹参转录组库中获得完整的SmWRKY65序列，根据序列设计引物克隆该基因，经测序后发现其编码区长度为867bp，共编码288个氨基酸，含有一个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构域，属于WRKY基因家族第IIa类成员，与预期结果一致。为了进一步研究其功能，我们克隆了SmWRKY65的编码区，构建了SmWRKY65的过表达载体，采用花序浸泡法将SmWRKY65转入拟南芥中，并获得阳性转基因植株，为下一步SmWRKY65的功能研究奠定基础。

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缩略词

第一章 文献综述

1.1 丹参概述

1.2 丹参酚酸类及丹参酮类成分生物合成途径及调控研究进展

1.3 WRKY转录因子参与植物次生代谢的研究进展

1.4 茉莉酸(JAs)信号在次生代谢调控中的作用

1.5 研究目的与意义

第二章 丹参转录组中WRKY转录因子的鉴定与生物信息学分析

2.1 引言

2.2 仪器、试剂与材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果

2.5 讨论

第三章 SmWRKY基因组织特异性表达分析

3.1 引言

3.2 仪器、试剂与材料

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

第四章 MeJA诱导条件下SmWRKY基因表达及其与丹参有效成分积累之间的关系

4.1 引言

4.2 仪器、试剂与材料

4.3 实验方法

4.4 实验结果

4.5 讨论

第五章 SmWRKY65基因在拟南芥中的遗传转化

5.1 引言

5.2 仪器、试剂与材料

5.3 实验方法

5.4 实验结果

5.5 讨论

第六章 总结

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果

致谢