家蚕环形RNA的鉴定与分析

摘要

环形RNA(circRNA)是具有闭合环状结构的单链RNA，其序列包含外显子信息，是基因转录后修饰的副产物。环形RNA广泛存在于真核细胞中，目前，在人和小鼠细胞中鉴定的环形RNA已达数千条，其功能涉及亲本基因的表达调控、miRNA的吸附和某些疾病的生物标志物，而家蚕环形RNA研究至今还未有相关报道。本研究通过高通量测序和生物信息学预测两种方法对家蚕环形RNA进行了规模化鉴定与分析，为家蚕乃至昆虫中新型RNA分子的鉴定和研究提供了参考。
　　本研究主要内容包括：⑴通过高通量测序方法，对家蚕中的环形RNA进行规模化鉴定与分析。提取家蚕总RNA，通过试剂盒去除其中的rRNA后进行高通量测序，共获得112271320个测序read。采用环形RNA预测软件mapsplice和findcirc从获得的测序read中预测环形RNA，其中mapsplice预测到环形RNA共9778条，而findcirc预测到环形RNA共1659条，两个预测软件共同预测到的环形RNA有1598条，为鉴定的家蚕潜在环形RNA分子。设计特异性的正反向PCR引物对，选取其中17条SRPBM最高的环形RNA，进一步开展环形RNA的正反向PCR鉴定。结果显示，选取的17条环形RNA中，有11条可以通过PCR实验鉴定，其中，BmcircR_3621、BmcircR_8955、BmcircR_8926、BmcircR_6123、BmcircR_8349、BmcircR1198、BmcircR9535、BmcircR6215和BmcircR_7937在家蚕中以环的形式存在，并且主要成环位点与生物信息学预测结果一致，而BmcircR2196和BmcircR6226的成环位点与预测存在差异。⑵通过生物信息学方法，对家蚕环形RNA进行进一步的预测鉴定和分析。基于环形RNA的结构特征，采用perl语言编写环形RNA预测程序环形RNApredictor.pl，基于NCBI数据库中的家蚕高通量测序read（SRR315361）和家蚕基因组序列，共预测到家蚕环形RNA12955条，进一步将高通量测序read匹配预测的环形RNA序列，结果表明，许多环形RNA序列的5'和3'末端匹配的read还存在部分伸出序列，而且5'末端匹配read部分伸出序列和3'末端序列相同;同样，3'末端匹配read部分伸出序列和5'末端序列相同，证实预测的序列首尾重叠，为环状分子。另外，分析发现许多预测环形RNA之间存在同源关系。令人感兴趣的是，环形RNA与基因组的匹配分析发现，环形RNA BmCirc2091935在基因组中存在7个相似性较高的大小约为850 bp的基序，每个基序均通过一段67 nt的序列串连。对RNase R处理的家蚕总RNA进行正反向PCR鉴定，成功扩增出BmCirc2091935的相应片段，证实其以环的形式存在。进一步Northem Blot鉴定，结果表明BmCirc2091935同样存在6种成环形式，不同成环形式环形RNA之间的大小差异推测为单个基序长度的倍数。由此，我们推测BmCirc2091935可能通过可变剪切连接不同数量的基序，从而生成不同成环形式的环形RNA，目前尚未有关于此类环形RNA的报道，其成环机制和功能还有待进一步研究。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 环形RNA

1．1 环形RNA的发现

1．2 国内外研究现状和发展趋势

1．3 环形RNA生成和功能

2 RNA可变剪切与环形RNA生成

2．1 可变剪切调控人类基因表达

2．2 可变剪切调控植物基因表达

2．3 可变剪切生成环形RNA

3 家蚕非编码基因调控

3．1 miRNA调控家蚕基因研究

3．2 piRNA调控家蚕基因研究

3．3 siRNA调控家蚕基因研究

3．4 可变剪切调控家蚕基因研究

4 展望

第二章 研究内容和技术路线

1 研究内容

2 技术路线

第三章 家蚕环形RNA高通量测序与分析

2．1 总RNA提取

2．2 测序文库构建

2．3 测序数据评估

2．4 环形RNA预测和筛选

2．5 环形RNA靶miRNA预测

2．6 引物设计

3 结果

3．1 碱基质量分布统计

3．2 碱基含量分布统计

3．3 数据过滤及统计

3．4 环形RNA预测结果

3．5 环形RNA靶miRNA预测结果

4 讨论

第四章 家蚕环形RNA的鉴定与分析

1 材料、试剂及仪器

1．1 主要试剂盒材料

1．2 主要仪器

1．3 试剂配置

2．2 PCR扩增

2．3 琼脂糖凝胶电泳鉴定

3．1 17个环形RNA的PCR扩增结果

3．2 11个环形RNA的PCR扩增结果

4 讨论

第五章 家蚕环形RNA的生物信息学预测与鉴定分析

1 材料、试剂及仪器

1．1 主要试剂盒材料

1．2 主要仪器

1．3 试剂配置

2 方法

2．1 家蚕环形RNA的生物信息学预测原理

2．2 家蚕环形RNA预测软件CircRNApredictor．pl的编写

2．3 生物信息学预测流程

2．4 预测环形RNA的匹配分析

2．5 基因组多拷贝环形RNA BmCirc2091935的序列分析

2．6 BmCirc2091935的正反向PCR鉴定

2．7 BmCirc2091935的Northern Blot鉴定

3 结果

3．1 家蚕环形RNA的预测结果与分析

3．2 BmCirc2091935生物信息学分析

3．3 BmCirc2091935基因组多拷贝分析

3．4 BmCirc2091935正反向PCR鉴定

3．5 BmCirc2091935基因组PCR鉴定

3．6 BmCirc2091935的Northern Blot鉴定

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附件