人iPS诱导分化为巨噬细胞及抗结核免疫功能检测

摘要

巨噬细胞(Macrophages，Mψ)是造血系统中最具可塑性的细胞，存在于所有的组织中，在细胞正常发育、体内平衡、组织修复和对病原体的免疫反应中扮演了许多不同的角色。结核(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的人兽共患慢性传染病，是严重威胁人类健康的三大感染性疾病之一。在抗MTB感染的免疫应答中，巨噬细胞是其主要的宿主细胞，所以研究巨噬细胞与MTB的相互作用对结核病的发生和发展起着非常重要的作用。目前实验研究用人类巨噬细胞多来源于肿瘤细胞系和外周血单核细胞。肿瘤细胞系来源的巨噬细胞容易发生遗传结构改变，造成功能缺失，外周血来源的巨噬细胞则获取困难且数量较少，如何获取大量有功能活性的巨噬细胞是研究的关键，诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPS)技术的出现为体外获得大量巨噬细胞提供了新思路。iPS是通过体外导入特定的转录因子基因将终末分化的体细胞重编程为具有胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ES)特性的多能细胞，即能够自我更新并可分化为3个胚层来源所有细胞的能力。iPS避免伦理道德和免疫排斥反应等局限而备受青睐。研究已证实iPS在体外特定诱导条件下，能够定向分化为巨噬细胞。iPS诱导分化为巨噬细胞的方法大致可以分为三类：通过iPS形成类胚体(Embryonic body，EB)；与小鼠骨髓基质细胞OP9，S17等共培养；在基质胶上添加不同细胞因子直接诱导分化。目前，iPS来源巨噬细胞的研究大都集中在肿瘤免疫等方面，尚缺乏iPS来源的巨噬细胞在抗结核免疫机理方面的研究。
　　本研究以人iPS(human iPS，hiPS)为靶细胞，体外诱导分化为巨噬细胞，并探讨了该巨噬细胞对卡介苗(BacillusCalmette-Guérin，BCG)的免疫功能。首先通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)，反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)，免疫细胞化学(immunocytochemistry)，EB分化实验等方法对hiPS进行多能性的检测，在此基础上，通过EB形成无饲养层法和OP9共培养两种方法诱导人iPS分化为巨噬细胞(iPS-Mψ)，并对无饲养层法来源的iPS-Mψ进行了细胞形态学观察、吉姆萨染色、非特异性酯酶染色(α-NAE)、吞噬功能和细胞表面特异性抗原表达检测等一系列鉴定。最后，利用BCG感染体外培养iPS-Mψ，并分析BCG对iPS-Mψ一氧化氮(nitric oxide，NO)的产生、肿瘤坏死因子-alpha(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的表达情况，同时以人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞（THP-1-Mψ）为对照。结果表明，hiPS经AKP染色呈阳性，表达Oct-4和Nanog;所形成的类胚体表达内胚层标记基因AFP，中胚层标记基因Gata-1和外胚层标记基因Nestin，表明靶细胞hiPS具有多能干细胞特性，能够用于后续分化实验;无饲养层类胚体形成的方法和以OP9为饲养层两种方法得到的iPS-Mψ具有巨噬细胞所特有的形态特征（圆形、椭圆形、梭形及不规则形等，部分细胞可见伪足和凸起）;进一步对iPS-Mψ进行特性和功能鉴定发现，iPS-Mψ吉姆萨染色和非特异性酯酶染色(α-NAE)染色阳性，并具有较强的吞噬能力，同时可检测到特异性的表面抗原白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）CD14、CD11b、CD40、CD68和组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）MHC-Ⅱ的表达。与未感染的对照组相比，BCG感染24 h后iPS-Mψ产生的NO和TNF-α的表达显著增加(P＜0.01)，细胞的凋亡率显著升高(P＜0.01)，Caspase-3的表达显著增加(P＜0.01)，而抑制了Bcl-2的表达显著减低(P＜0.01)。

目录

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论文说明

摘要

缩略语

第一章 绪论

1 引言

1．1 诱导性多能干细胞概述

1．2 iPS诱导分化为巨噬细胞的方法体系

1．3 体外诱导iPS分化为巨噬细胞的常用诱导物

2 实验目的与意义

3 实验内容及设计方案

3．1 本课题研究内容

3．2 技术路线

第二章 人iPS体外培养与特性鉴定

1．2 主要溶液的配置

2 实验方法

2．1 hiPS培养

2．2 碱性磷酸酶(AKP)染色

2．3 免疫荧光

2．4 RNA的提取

2．5 RT-PCR

2．6 qRT-PCR

3 结果与分析

3．1 hiPS的培养及形态学观察

3．2 AKP染色

3．3 RT-PCR检测hiPS多能性基因的表达

3．4 免疫细胞化学检测hiPS多能性基因的表达

3．5 hiPS的分化能力检测

4 讨论

第三章 人iPS来源巨噬细胞诱导分化体系的建立

1 实验材料与试剂

1．2 主要溶液的配置

2 实验方法

2．1 小鼠骨髓基质细胞OP9细胞培养

2．3 THP-1细胞诱导成为巨噬细胞

2．4 OP9细胞饲养层的处理

2．5 hiPS与OP9饲养层细胞共培养的诱导分化途径

2．6 hiPS形成EB的诱导分化途径

2．7 hiPS来源巨噬细胞的鉴定

3．1 共培养诱导分化的途径

3．2 EB诱导分化的途径

3．3 hiPS来源的巨噬细胞的鉴定

4 讨论

第四章 人iPS来源巨噬细胞抗结核免疫功能检测

1 实验材料与试剂

1．1 材料与试剂

1．2 主要溶液的配制

2 实验方法

2．1 BCG感染

2．2 细胞凋亡检测

2．3 细胞裂解液的制备

2．4 蛋白浓度测定

2．5 蛋白质印迹法检测蛋白表达与激活

2．6 上清中NO的检测

2．7 上清中TNF-α的检测

3 结果与分析

3．1 流式细胞仪检测BCG刺激后的细胞凋亡

3．2 BCG刺激后上清中NO的表达检测

3．3 BCG刺激后上清中TNF-α的表达检测

3．4 BCG刺激后检测凋亡相关蛋白的表达变化

4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢