三唑磷作用下斑马鱼miR-203和miR-217对nup43调控作用的研究

摘要

miRNA的作用是通过同靶mRNA的3'端靶向结合降解或者是抑制其靶基因翻译，进而可以对靶基因的转录后进行调控。另miRNA可识别相应的靶基因且不是单一映射关系，同时存有多个不同miRNA调控同一靶基因，而miRNA也可以调控多个不同的靶基因。我们前期预测发现斑马鱼中nup4是miR-203的靶基因，并且在三唑磷，化学名称O，O-二乙基-O-（1-苯基-1，2，4-三唑-3-基）硫代磷酸酯的胁迫下nup43的表达受miR-203的调控。
　　本研究利用MicrocosmTargets软件预测得出nup43为miR-203与miR-217共同调控靶基因，通过实验验证了这2个miRNAs分别与nup4之间的关系。评估了三唑磷暴露下斑马鱼中这2个miRNAs的表达，研究2种miRNAs能否调控nup43的表达，结果发现随着三唑磷处理浓度的升高，斑马鱼中miR-203基因的表达量显著上调，斑马鱼中miR-217基因的表达量显著下调。miRNA可作为环境化学物质或致癌基因得生物标记物。为了解释三唑磷处理后miRNA表达的变化，进一步验证生物信息学预测的结果。我们通过将nup433'-UTR中miR-203和miR-217结合位点分别敲除，成功构建了2个重组海肾荧光素酶载体，分别命名为pRL/S-K.O-203、pRL/S-K.O-217。通过双荧光素酶报告基因法验证了斑马鱼nup433'-UTR中存在miR-217的结合位点。通过对ZF4细胞转染miR-217 mimic后，检测细胞中nup43的表达量，发现nup43在mRNA水平及蛋白水平都显著下调，而转染miR-217 inhibitor后，nup4的mRNA水平及蛋白水平则显著上调，但对ZF4细胞转染miR-203mimic后，其nup43表达量为上调，但转染miR-203 inhibitor后，其nup43表达量为显著下调。依上述可得，nup43是miR-203和miR-217的靶基因，在三唑磷暴露下miR-203与miR-217的变化表明其可以作为暴露于三唑磷环境的生物标志物。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 miRNA(microRNA)

1．1 miRNA的发现历程

1．2 miRNA的形成与作用机制

1．3 miRNA在毒理学中研究应用

1．4 miR-203和miR-217的研究进展

2 miRNA的生物信息研究方法

3 miRNA分子生物研究方法

3．1 基因芯片方法检测miRNA表达

3．2 Northern Blot方法检测miRNA表达

3．3 荧光定量PCR检测miRNA的表达

3．4 生物信息学预测miRNA靶基因

3．5 生物学实验预测miRNA靶基因

3．6 生物学实验验证miRNA靶基因

4 核孔蛋白nup(nup43)

5 斑马鱼与三唑磷

第二章 实验方案设计

1 研究目的与意义

2 研究主要内容

2．5 miR-203和miR-217分别对nup43 mRNA的调控作用

2．7 miR-217对斑马鱼细胞凋亡调控作用

3 实验流程图

第三章 材料与方法

1 材料与试剂

1．1 实验材料

1．2 主要仪器

1．3 主要试剂及来源

2 实验方法

2．1 三唑磷处理斑马鱼

2．2 各组斑马鱼组织的总RNA提取

2．3 总RNA的定量与完整性检溯

2．5 斑马鱼nup43靶miRNA筛选

2．6 反转录与荧光定量PCR

2．7 nup43 3’UTR突变序列克隆和载体构建

2．8 验证miRNA与nup43 3’UTR作用关系

2．9 miRNA对nup43 mRNA与蛋白水平的调控

2．10 总蛋白实验

2．11 ZF4细胞流式凋亡实验

第四章 结果与分析

1 斑马鱼的总RNA

2 基因调控网络

2．2 分析lncRNA-miRNA-mRNA网络调控基因

2．3 GO功能分析与结合结构

3 nup43靶miRNA预测

4 三唑磷处理前后斑马鱼2种miRNA表达检测

5 重组质粒构建与验证

5．1 目的片段PCR扩增

5．2 重组质粒PCR验证与酶切验证

5．3 测序验证

5．4 质粒质量检测

5．5 293T细胞转染效率测定

5．6 荧光信号数据处理

5．7 ZF4细胞mimics转染效率

5．8 异位表达的miR-203和miR-217分别对nup43 mRNA的调控作用

6 免疫印迹相关实验

6．1 蛋白定量结果分析

6．2 血抗ELISA效价测定

6．3 血抗对nup43蛋白westering blotting

6．4 三唑磷对斑马鱼中nup43蛋白水平的调控

6．5 ZF4细胞miRNA-203／217异位表达调控nup43蛋白水平情况

7 miR-217异位表达对细胞凋亡作用

第五章 讨论

第六章 总结与展望

参考文献

致谢