藏丹参与紫花丹参中丹参酮和丹酚酸代谢差异研究

摘要

紫花丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一种药用模式植物，广泛用于治疗心血管疾病。藏丹参（Salvia castanea Diels f.tomentosa Stib）与紫花丹参有着相似的药理作用，作为一种地方习俗用药替代丹参使用。藏丹参和紫花丹参积累不同水平的天然产物，如丹参酮和丹酚酸，但其分子机制尚不明确。本研究通过对比正常培养条件和不同诱导条件下藏丹参与紫花丹参毛状根的次生代谢差异，揭示两种丹参毛状根的次生代谢物积累差异以及它们对生物胁迫、非生物胁迫和信号分子的差异响应。这为研究藏丹参和紫花丹参次生代谢差异提供初步的基础，也为植物组织工程提供有利的参考。此外，对比两种丹参中参与多个代谢途径的关键基因的转录水平，筛选得到一些参与特定代谢的候选基因，为进一步研究其功能提供基础。
　　本研究主要内容包括：⑴对正常培养条件下藏丹参和紫花丹参毛状根中次生代谢物进行高效液相分析，结果表明藏丹参比紫花丹参产生更高水平的隐丹参酮(CT)、丹参酮ⅡA(T-ⅡA)、咖啡酸(CA)和迷迭香酸(RA)，而产生更低水平的二氢丹参酮Ⅰ(DT-Ⅰ)和丹酚酸B(SAB)。⑵应用水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate，LH)诱导紫花丹参和藏丹参毛状根，先进行LH浓度优化，再进行时间梯度实验。LH浓度筛选结果表明1g/LLH可以作为一种优化浓度的诱导子，既有利于两种丹参毛状根生长，又促进丹参酮积累。LH诱导的时间梯度实验表明1 g/LLH诱导对两种丹参的丹参酮生物合成有一定的促进作用，而对丹酚酸积累影响较小。此外，与紫花丹参相比，1g/LLH更有利于藏丹参中丹参酮的积累，藏丹参中DT-Ⅰ、CT、丹参酮Ⅰ(T-Ⅰ)和T-ⅡA积累在诱导后第9d达到最高水平，分别是对照组的2.00倍、3.55倍、3.91倍和1.24倍。与紫花丹参相比，LH诱导藏丹参中HMGR、DXR、GGPPS和CYP76AH1更持久的上调，可能导致藏丹参产生更强烈的丹参酮代谢响应。⑶为了揭示藏丹参和紫花丹参毛状根对生物和非生物诱导子的差异响应，使用酵母提取物(YE)、Ag+和茉莉酸甲酯(MJ)分别诱导藏丹参和紫花丹参毛状根。YE可以诱导紫花丹参中DT-Ⅰ、CT、CA和RA产生，而显著促进藏丹参中DT-Ⅰ、CT、T-Ⅰ、T-ⅡA和CA的积累;Ag+在特定时间诱导紫花丹参中CT、T-Ⅰ、T-ⅡA、CA和RA的产生，而增加藏丹参中CT、T-ⅡA、RA和SAB积累;MJ显著促进藏丹参中DT-Ⅰ、CT、T-ⅡA、CA、RA和SAB积累，而仅仅影响紫花丹参中DT-Ⅰ、CT、CA和SAB的产生。基因表达分析表明两种丹参中关键基因对诱导子的差异响应可能导致两者产生不同的丹参酮和丹酚酸代谢响应。⑷为了筛选藏丹参和紫花丹参次生代谢相关的一些候选基因，对藏丹参和紫花丹参毛状根中关键基因的转录水平进行比较。结果表明在萜类化合物生物合成途径中，有10个基因在藏丹参中高表达，而31个基因在紫花丹参中高表达。在酚酸类化合物生物合成途径中，有6个基因在藏丹参中高表达，而11个基因在紫花丹参中高表达。细胞色素P450中有12个基因在藏丹参中高表达，而另有12个基因在紫花丹参中高表达。转录因子中有3个基因在藏丹参中高表达，而1个基因在紫花丹参中高表达。⑸组织特异性表达分析表明CYP71AT90、CYP94C55、CYP82V2、CYP749A39、CYP721A38、CYP76AK3和ORA1在丹参的根中高表达，而CYP736A123和CYP716A89在丹参的叶中高表达。此外，使用Gateway技术构建了丹参SmCYP749A39、SmCYP71AT90和SmWRKY61的过表达载体。

目录

声明

论文说明

摘要

第一章 文献综述

1．1 丹参概述

1．2 丹参次生代谢途径研究

1．2．1 丹参二萜化合物生物合成研究进展

1．2．2 丹参酚酸类化合物生物合成研究进展

1．3 丹参次生代谢调控研究进展

1．3．1 丹参酮生物合成调控

1．3．2 丹参酚酸类化合物生物合成调控

1．3．3 转录水平调控

1．4 丹参组学研究进展

1．5 研究目的和意义

第二章 两种丹参毛状根中次生代谢产物积累及其相关基因表达差异

2．1 引言

2．2 实验仪器、试剂与材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验材料

2．3 实验方法

2．3．1 紫花丹参和藏丹参毛状根培养

2．3．2 次生代谢物质含量测定

2．3．3 基因表达分析

2．4．1 正常生长条件下两种丹参毛状根的生长差异

2．4．2 正常生长条件下两种丹参毛状根中次生代谢物积累差异

2．4．3 正常生长条件下两种丹参毛状根中基因表达差异

2．5 讨论

第三章 生物和非生物诱导子对两种丹参毛状根次生代谢的影响及其机制

3．1 引言

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验材料

3．3．2 诱导子制备和毛状根诱导处理

3．3．3 次生代谢物质含量测定

3．3．4 基因表达分析

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 LH诱导下紫花丹参和藏丹参毛状根生长与次生代谢差异

3．4．2 藏丹参和紫花丹参对YE、Ag+和MJ的差异响应

第四章 两种丹参毛状根中细胞色素P450及转录因子基因表达差异

4．1 引言

4．2 实验仪器、试剂与材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 基因表达分析

4．4 实验结果

4．4．1 藏丹参和紫花丹参毛状根中细胞色素P450和转录因子基因表达差异

4．5 讨论

第五章 候选基因功能研究

5．1 引言

5．2 实验仪器、试剂与材料

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验试剂

5．3 实验方法

5．3．1 基因表达分析

5．3．2 过表达载体的构建

5．3．3 目的基因过表达载体的转化

5．4 实验结果

5．4．1 细胞色素P450的进化分析

5．4．2 紫花丹参中关键基因的组织表达分析

5．4．3 CYP71AT90、CYP749A39和WRKY61过表达载体的构建

5．5 讨论

第六章 总结

参考文献

附录

攻读学位期间的研究成果

致谢