MiR394在植物与灰霉菌互作中的生物学功能及调控机制研究

摘要

植物在生长发育过程中很容易受到周围环境的影响，由病原体灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的番茄灰霉病是危害番茄生产的主要因素之一。根据课题组前期的研究结果显示，miR394响应灰霉菌的感染。本研究利用过表达miR394的转基因拟南芥和lcr突变株拟南芥，进一步明确了miR394在番茄防御灰霉病过程中的功能及其作用机制，主要研究结果如下:
　　1、用灰霉菌处理Micro-Tom番茄，在不同时间点进行样品采集，qRT-PCR结果表明，miR394参与植物对灰霉菌的防御。
　　2、为了进一步确定miR394的功能作用，我们将过表达miR394的转基因及其靶基因lcr的突变株拟南芥接种灰霉菌。发现与野生型相比，过表达miR394的转基因拟南芥和lcr突变株拟南芥的叶片表面均出现较大的病变面积，且综合台盼蓝染色的结果，说明拟南芥miR394通过直接作用于靶基因LCR作为拟南芥防御灰霉菌感染的负调节剂，使得植物对灰霉菌更加敏感。
　　3、转基因株系中miR394的过表达对其它胁迫相关miRNAs产生影响。利用qPCR检测结果显示除miR159以外，miR156、miR168以及miR172的表达水平在各个株系中均上调，表明这些miRNAs与miR394存在潜在联系。
　　4、对miRNA合成和作用过程中的7个相关蛋白基因在转基因株系中进行表达检测，其中DDL、DRB4和AGO1共3个基因的表达上调，说明miR394的过表达对这些基因具有正反馈作用。
　　5、植物中的两条激素调节途径:茉莉酸及水杨酸途径中的4个关键基因在过表达miR394的转基因植株和lcr突变株中被检测，高水平的miR394或低水平的LCR均导致PDF12(Plant Defensin1.2)和PR4(Pathogenesis-Relatedprotein4)表达量的增加，这可能也作为一种潜在的影响因素，使得miR394/LCR对灰霉菌感染的敏感性增强。
　　6、已有相关报道揭示miR394参与植物的非生物胁迫应答，我们对此进行了验证，并得到一致的结果，说明miR394的过表达使得拟南芥耐旱而不耐盐。
　　本研究探讨了miR394/LCR在拟南芥抵抗灰霉菌中的作用，明确了miR394/LCR在应答灰霉菌时可能协同JA/SA途径的相关基因。这些研究将为进一步明确miR394/LCR的调控机制和灰霉菌的分子防治提供技术依据。

目录

声明

摘要

图清单

表清单

缩略表

第一章 引言

1．灰霉菌的危害及其防治手段

2．miRNA的研究进展

2．1 miRNA的发现

2．2 miRNA的合成

2．3 miRNA星号链

2．4 miRNA的作用机制

2．5 miRNA对胁迫的应答

2．6 miRNA功能的研究方法

2．7 miR394的研究进展

3．茉莉酸、水杨酸途径相关基因

4．研究目的和意义

第二章 材料与方法

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器和设备

2．实验方法

2．1 拟南芥和番茄植株栽培

2．2 灰霉菌培养

2．3 番茄植株处理

2．4 植物RNA提取及RT-PCR

2．5 Quantitative PCR(qPCR)检测

2．6 PCR模板快速制备

2．7 台盼蓝染色

2．8 统计学分析

2．9 非生物胁迫处理

第三章 实验结果

1．MiR394在番茄和拟南芥中的组织特异性表达

1．1 MiR394及其初级转录本在番茄不同组织中的表达

1．2 MiR394在拟南芥不同组织中的表达

2．MiR394响应灰霉菌的侵染

2．1 MiR394及其初级转录本在接种灰霉菌的番茄叶片中的表达动态

2．2 MiR394及其初级转录本在接种灰霉菌的拟南芥叶片中的表达动态

3．转基因和突变株验证

3．1 过表达miR394转基因拟南芥的获得和阳性检测

3．2 Lcr突变株纯合鉴定

4．过表达miR394的转基因拟南芥对生物胁迫和非生物胁迫的响应

4．1 生物胁迫

4．2 非生物胁迫

5．Lcr突变株对灰霉菌的响应

5．1 Lcr突变株增强了植株对灰霉菌的易感性

5．2 Lcr的突变对JA／SA信号传导途径中基因的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

攻读学位期间的研究成果

致谢