猪圆环病毒2型ORF3’表达、抗体制备及ORF3’表达缺失突变株的构建

摘要

目的：猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是一种引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated disease，PCVAD)的主要致病因子。但是，PCV2致病的分子机制到目前仍未阐明。在对PCV2基因组研究中，已有6个开放阅读框(ORFs)得到了初步验证，其中ORF1编码Rep蛋白与复制功能相关，ORF2编码Cap蛋白是病毒外壳蛋白，ORF3蛋白参与细胞凋亡，ORF4蛋白参与细胞凋亡的抑制，ORF5蛋白参与细胞内质网的应激，ORF6蛋白可增强病毒的复制。本实验室之前的研究中通过RT-PCR和快速扩增cDNA末端技术发现了一种新转录物ORF3'，但是目前对其生物功能尚不清楚。本研究通过ORF3'蛋白的表达和制备多克隆抗体检测了其在细胞内的表达，构建了PCV2ORF3'表达缺失病毒，为进一步研究其在病毒复制、转录和致病性中的作用奠定了基础。
　　方法：首先在实验室已有研究的基础上，按照毕赤酵母表达系统密码子优化的ORF3'序列合成GST-ORF3'并连接至pPIC9k质粒，线性化后电转入GS115感受态细胞中，筛选表型后诱导表达目的蛋白GST-ORF3'。以pPIC9k-ORF3'-GST重组质粒为模板扩增GST-ORF3'片段，pGEX-4T-1质粒和PCR产物双酶切后连接构建重组表达载体pGEX-4T-ORF3'，转化大肠杆菌诱导表达GST-ORF3'蛋白;纯化表达蛋白后制各兔多克隆抗体。对PCV2全序列分析后选择突变位点，通过改变起始和终止密码子使ORF3'的蛋白翻译过程无法正常进行，构建自环化突变型质粒并转染PK15细胞回收突变病毒，通过Western blot和IFA检测病毒感染稳定性和相关蛋白表达。
　　结果：(1)成功将pPIC9k-GST-ORF3'线性化后电转入GS115酵母细胞并对筛选的Mut+表型的重组酵母诱导表达目的蛋白，但未检测到目的蛋白的产生;(2)成功构建原核表达载体pGEX-4T-ORF3'，通过测序和相应引物PCR鉴定正确后在大肠杆菌BL21中成功诱导表达了GST-ORF3'蛋白，通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达后割胶纯化目的蛋白;(3)将纯化的蛋白免疫新西兰兔后获得抗GST-ORF3'抗血清，通过Western blot对GST-ORF3'进行检测证明其具有反应特异性;(4)成功构建了在PK15细胞中可连续传代并具备感染能力的重组野生型和突变型病毒;(5)对感染野生型病毒的PK15细胞进行免疫荧光鉴定，观察到ORF3'蛋白在PK15细胞中存在，表明ORF3'基因可以在PK15细胞中表达。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 绪论

1 PCV概述

1．1 分类地位

1．2 理化特征

1．3 培养特征

1．4 流行病学

2 PCV的分子生物学特征

2．1 病毒的基因组结构

2．2 转录与复制

2．3 PCV2的开放阅读框

3 猪圆环病毒2型分子致病机制

3．1 ORF1在病毒致病性中的作用

3．2 ORF2在病毒致病性中的作用

3．3 ORF3在病毒致病性中的作用

3．4 ORF4在病毒致病性中的作用

4 猪圆环病毒研究分析技术

4．1 感染性克隆的构建

4．2 间接免疫荧光

4．3 荧光定量PCR

5 本研究的目的与意义

第二章 毕赤酵母真核表达PCV2 ORF3’

1 材料

1．1 载体和菌株

1．2 酶和主要试剂

1．3 培养基

2 方法

2．1 引物设计

2．2 重组质粒鉴定

2．3 质粒提取

2．4 质粒的线性化

2．5 酵母感受态细胞的制备

2．6 酵母感受态细胞电转化

2．7 真核表达酵母的鉴定

2．8 酵母的诱导表达

2．10 免疫印迹鉴定(Western blot)

3．结果与分析

3．1 GST-ORF3’基因的鉴定

3．2 重组质粒PCR鉴定

3．3 通用引物AOX对pPIC9k-GST-ORF3’重组质粒的鉴定

3．4 重组酵母表型的筛选

3．5 酵母诱导表达

3．6 对诱导表达蛋白Western blot鉴定

4 小结与讨论

第三章 PCV2 ORF3’的克隆、原核表达及蛋白纯化

1 实验材料

1．1 载体和菌株

1．2 酶和试剂

2 实验方法

2．1 引物的设计

2．2 目的基因的扩增

2．3 构建pGEX-4T-ORF3’重组质粒

2．4 转化与鉴定

2．5 蛋白的原核表达与鉴定

2．6 表达蛋白Western blot鉴定

2．7 蛋白纯化

3 结果与分析

3．1 ORF3’基因的扩增

3．2 原核表达载体pGEX-4T-1双酶切

3．3 重组质粒pGEX-4T-ORF3’ PCR鉴定

3．4 测序对比鉴定

3．5 IPTG诱导后SDS-PAGE电泳结果

3．6 Western blot检测目的蛋白

3．7 蛋白纯化

4 小结与讨论

第四章 GST-ORF3’多克隆抗体的制备及检测

1 材料

1．1 实验动物

1．2 常用试剂盒耗材

2 方法

2．1 抗原准备

2．2 免疫及血清的采集

2．3 Western blot鉴定

2．5 细胞传代及培养

2．6 病毒的感染和扩繁

2．7 免疫荧光检测PK-15细胞

3．结果与分析

3．1 GST-ORF3’抗体检测

3．2 间接免疫荧光

4 小结与讨论

第五章 PCV2 ORF3’表达缺失株的构建

1 实验材料

1．1 病毒细胞和载体

1．2 试剂

2 实验方法

2．1 对PCV2序列分析及设计引物

2．2 构建PCV2突变体重组质粒

2．3 病毒DNA的环化

2．4 重组型病毒与突变型病毒的获得

2．5 病毒DNA的检测

2．6 间接免疫荧光检测突变型病毒

3 结果与分析

3．1 突变位点的选择

3．2 质粒酶切鉴定

3．3 序列测序结果分析

3．4 自环化产物PCR鉴定

3．5 病毒稳定性检测

3．7 对突变型病毒的免疫荧光检测

4 小结与讨论

结论

参考文献

致谢