水解丝素蛋白结构性能调控与其止血机制研究

摘要

在战争和日常生活中，突发性创伤出血不可避免，快速止血是实施紧急医疗救治的重要步骤。研究表明，常用的止血材料沸石、明胶海绵、壳聚糖、氧化纤维素等存在生物相容性不高、易引起感染、制备复杂、价格昂贵、止血速度慢等问题。蚕丝是一种天然高分子蛋白纤维，具有无生物毒性、炎症反应低、可生物降解、易加工成型等优点，在生物传感器、药物缓释载体、组织工程等医用产品上已有成熟的应用。但是，有关蚕丝纤维在止血材料方面的应用研究报道较少。将蚕丝纤维应用于止血材料的制备，不仅有望改善止血材料的止血性能和生物相容性，也可以为丝素蛋白止血材料的开发和止血机制的研究提供研究方法和理论基础。 本论文以蚕茧作为初始原料，茧丝经脱胶后制得丝素蛋白，采用不同方法和条件水解丝素大分子蛋白，重点研究水解丝素蛋白材料的结构、分子量、溶解性和表面电位与止血性能之间的相关性及各因素间的协同效应，旨在揭示水解丝素蛋白材料的止血机制。具体包括以下三方面研究工作:(1)采用盐解法和酶解法（包括单酶解法、双酶二步酶解法和添加介孔生物活性玻璃复合法）制备水解丝素蛋白材料，研究不同的水解体系和条件对水解丝素蛋白材料的表面形貌、分子量、溶解性及表面电位的影响;(2)采用体外凝血性能测试体系和动物肝脏出血模型研究水解丝素蛋白材料的结构、分子量、溶解性和表面电位对其止血性能的影响，揭示不同水解体系和条件下丝素蛋白材料止血性能的主要差异及原因;(3)通过表征水解丝素蛋白材料的活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、血小板粘附、血小板第4因子(PF4)含量和血液粘度等指标，剖析水解丝素蛋白材料的结构和理化性能与凝血因子、血小板、血液粘度等之间的关联性，阐明水解丝素蛋白材料促进凝血的途径，揭示水解丝素蛋白材料的止血机制。 研究结果表明:(1)盐解法和酶解法制备的水解丝素蛋白材料均具有粗糙疏松多孔的结构、有一定粘性且在模拟血液的环境中均可溶并带负电性。但不同水解方法所得丝素蛋白材料的表面形貌、分子量、溶解速度和表面电位存在明显差异。与盐解法相比，酶解法所得水解丝素蛋白材料的蜂窝状或孔穴状结构更明显、分子量更低、溶解速度更快、负电性更强。与单酶解法相比，双酶二步法酶解作用增强，酶解丝素蛋白产物中低分子量组分显著增多，负电性增强;(2)盐解法和酶解法制备的水解丝素蛋白材料的分子量、溶解性、表面电位与其止血性能密切相关。水解丝素蛋白分子量越低，溶解速度越快，在模拟血液环境中负电性增强，相应的止血性能更好。酶解法可以制备更多低分子量丝素蛋白，具有较低的Zeta电位和良好的体外促凝血性能和体内止血效果，其中，碱性蛋白酶法、双酶二步酶解法和添加15％介孔生物活性玻璃复合水解制备的丝素蛋白材料的止血效果均优于云南白药;(3)凝血因子、血小板、血液粘度等指标与水解丝素蛋白材料的结构和理化性能密切相关。随着水解丝素蛋白材料负电性增强，APTT时间减小，引发血浆中凝血因子Ⅻ的激活，对内源性凝血有促进作用;血小板在水解丝素蛋白材料表面粘附量增多，PF4的释放量增加，止血性能增强;水解丝素蛋白材料蜂窝状或孔穴状结构越明显，血液粘度增大，促进凝血形成，有利于止血。尤其分子量更低、负电性更强的酶解丝素蛋白材料对血小板具有很强的粘附作用和激活作用;(4)水解丝素蛋白材料与血液接触时通过多种因素共同作用下促进止血完成，包括:通过液相激活血液中凝血因子Ⅻ，加速启动内源性凝血途径，诱导凝血酶产生，并通过负电性表面加速诱导血小板粘附和激活促进血小板血栓的形成，同时其粗糙疏松多孔物理结构可吸收血液中液态物质，使血液粘稠，促进凝血形成。

目录

声明

论文说明

摘要

1．1研究背景及意义

1．2止血材料研究概述

1．2．1多孔无机盐类止血材料

1．2．2生物高分子类止血材料

1．2．3其他生物材料类止血材料

1．3止血材料止血机制的研究进展

1．3．1血液凝固机制

1．3．2止血材料的止血机制

1．4丝素蛋白在生物医用材料领域的研究进展

1．4．1丝素蛋白的结构性能与制备

1．4．2药物缓释材料

1．4．3组织工程支架材料

1．4．4止血材料

1．5本论文的创新与特色

1．6本论文的研究目标和主要研究内容

1．6．1研究目标

1．6．2主要研究内容

2．1．1主要实验原料

2．1．2主要实验仪器

2．2水解丝素蛋白材料的制备方法

2．2．1盐解法

2．2．2酶解法

2．3测试和表征

2．3．1形态结构和基本理化性能

2．3．2止血性能特征指标

2．4统计学分析

第三章盐法水解对丝素蛋白结构和止血性能的影响

3．1盐解条件对丝素蛋白形态结构的影响

3．1．1表面形貌分析

3．1．2孔隙率分析

3．2盐解条件对丝素蛋白分子结构的影响

3．2．1分子量及分子量分布分析

3．2．2氨基酸分析

3．2．3 FTIR分析

3．2．4 XRD分析

3．3盐解条件对丝素蛋白溶解性能的影响

3．3．1水溶性分析

3．3．2溶液稳定性分析

3．4盐解条件对丝素蛋白表面电位的影响

3．5盐解丝素蛋白材料的体外促凝血性能研究

3．6盐解丝素蛋白材料的体内止血性能研究

3．7本章小结

第四章酶法水解对丝素蛋白结构和止血性能的影响

4．1酶法水解对丝素蛋白形态结构的影响

4．2酶法水解对丝素蛋白分子结构的影响

4．2．1分子量及分子量分布分析

4．2．2 FTIR分析

4．2．3 XRD分析

4．3酶解丝素蛋白材料的溶解性能研究

4．4酶解丝素蛋白材料的表面电位研究

4．5酶解丝素蛋白材料的体外促凝血性能研究

4．5．1单酶种类的影响

4．5．2溶液浓度的影响

4．5．3材料状态的影响

4．5．4 M58S含量的影响

4．5．5酶解方式的影响

4．6酶解丝素蛋白材料的体内止血性能研究

4．7本章小结

第五章水解丝素蛋白材料的止血机制研究

5．1水解丝素蛋白材料对凝血因子的影响

5．2水解丝素蛋白材料对血小板粘附的影响

5．3水解丝素蛋白材料对血小板第4因子的影响

5．4水解丝素蛋白材料对血液粘度的影响

5．5水解丝素蛋白材料的止血机制分析

5．6本章小结

6．1结论

6．2展望

参考文献

已取得的研究成果

致谢