中国被毛孢活性物质分离纯化及结构鉴定

摘要

冬虫夏草是中国传统药物之一（Cordyceps sinensis），意为“冬天为虫、夏天为草”。在中国，冬虫夏草一般用于补肾、益肺、保持和提高身体的整体健康水平，并能够治疗疲劳、夜间盗汗、高血糖、高血脂、肾功能不全等疾病。由于冬虫夏草的独特药用价值，市场需求量不断增加，且野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，本身资源比较有限，因此，人工发酵获得冬虫夏草无性型菌丝体及其活性成分，成为一种可行并可持续发展的方法。在形态学和分子生物学的基础上，中国被毛孢（Hirsutella sinensis）已证实为天然冬虫夏草的无性型菌株。
　　本论文围绕中国被毛孢发酵菌丝体展开研究。取发酵菌丝体，用超纯水清洗3次，减压抽滤，然后将菌体置于烘箱，60℃干燥至恒重。干燥后菌丝体用粉碎机捣成粉末，于4℃密封冷藏，用于接下来的研究。
　　论文首先采用凯式定氮法测得中国被毛孢发酵菌丝体中总蛋白含量为383.4 mg/g，发酵滤液中总蛋白为10.804 mg/mL。氨基酸自动分析仪测得中国被毛孢中氨基酸总含量为306.28 mg/g，比天然冬虫夏草(292.4 mg/g)高，其中组氨酸、精氨酸、谷氨酸含量最高，分别为40.93、36.13、28.25 mg/g。显色法检测得中国被毛孢菌丝体中虫草酸的平均含量为10.99％，并最终确定最佳提取条件为:40℃下，用超纯水提取3次，每次1小时。在最优条件下，虫草酸的含量为11.37％。另外，中国被毛孢中主要包括尿嘧啶、鸟苷、腺嘌呤、腺苷和虫草素等核苷类物质，其含量分别为0.123 mg/g、0.308 mg/g、0.551mg/g、0.823 mg/g、0.308 mg/g，均在天然冬虫夏草含量范围之内。火焰原子吸收光谱法检测出中国被毛孢发酵菌丝体中含有多种元素，其中以Na、K含量最高，分别为1582.9 mg/g、9247 mg/g，其它元素，如Mg、 Ca、Fe、Zn、Cu、Mn、Si、Ni均在天然冬虫夏草平均含量范围之内，潜在毒性元素Pb、Co、Hg均安全值之内。
　　其次，采用索氏提取法从中国被毛孢发酵菌丝体中提取粗脂肪，对粗脂肪甲酯化后，气相色谱-质谱分析其脂肪酸组分。接着对脂肪酸类物质进行分离纯化，并最终确定其结构。中国被毛孢发酵菌丝体中粗脂肪的含量为5.66％，略低于天然冬虫夏草中8.4％的含量。GC-MS确定其脂肪酸组分中主要包括油酸、亚油酸、棕榈酸，不饱和脂肪酸含量为90.17％。通过分离纯化得到EP-1和EP-2两种化合物，并通过现代波谱技术确定其结构，EP-1为十六烷酸即棕榈酸，EP-2为十八烯酸乙酯即油酸乙酯。
　　最后，本论文采用超声提取法从中国被毛孢发酵菌丝体中提取多糖，经活性炭脱色、Saveg法去蛋白得精制多糖，苯酚-硫酸法测得中国被毛孢中的总多糖含量为3.848％。利用DEAE离子交换柱、葡聚糖凝胶柱和丙烯葡聚糖凝胶柱层析分离得到两种纯化多糖。超纯水洗脱部位得中性多糖HSP-1，0.1 mol/L NaCl洗脱部位得酸性多糖HSP-2。对HSP-1和HSP-2乙酰化后进行GC-MS检测，确定它们的单糖组成为甘露糖、阿拉伯糖和葡萄糖，摩尔比分别为0.34∶0.38∶1及0.28∶0.24∶1。通过高效凝胶渗透色谱及示差折光检测器确定HSP-1和HSP-2的分子量分别为3.5×103 kDa和3.4×103 kDa，接着利用红外光谱、核磁共振等手段判断HSP-1和HSP-2主要由β-糖苷键连接，HSP-1含有少量α-糖苷键。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 冬虫夏草生态生物学特性

1．1．1 地理分布

1．1．2 生态环境

1．1．3 生物学特性

1．2 冬虫夏草的人工培养

1．3 冬虫夏草活性成分

1．3．1 粗成分

1．3．2 虫草酸

1．3．3 虫草素

1．3．4 核苷类

1．3．5 脂肪酸

1．3．6 氨基酸

1．3．7 维生素

1．3．8 甾醇类

1．3．9 金属元素

1．3．10 多糖

1．4 冬虫夏草的生理活性

1．4．1 免疫调节功能

1．4．2 肾功能保护作用

1．4．3 抗疲劳及镇静催眠作用

1．4．4 抗氧化活性

1．4．5 抗肿瘤作用

1．4．6 糖尿病预防作用

1．4．7 改善亚健康作用

1．5 本课题研究内容及意义

1．5．1 本课题的研究内容

1．5．2 本课题的研究意义

参考文献

第二章 中国被毛孢活性成分的提取与检测

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验仪器与化学试剂

2．2．2 试验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 虫草酸含量及提取条件优化

2．3．2 TLC法测定核苷类物质的存在

2．3．3 HPLC法测定核苷类物质的含量

2．3．4 粗蛋白及氨基酸含量的测定

2．3．5 金属元素含量的测定

2．4 本章小结

参考文献

第三章 中国被毛孢脂肪酸类物质的检测、提取及鉴定

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 实验仪器

3．2．2 化学试剂与材料

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 中国被毛孢中粗脂肪含量

3．3．2 挥发性组分GC-MS分析

3．3．3 石油醚萃取部位分离纯化

3．3．4 化合物的结构鉴定

3．4 本章小结

参考文献

第四章 多糖含量的检测、分离纯化及结构鉴定

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验仪器

4．2．2 化学试剂与材料

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 中国被毛孢中多糖含量

4．3．2 多糖的分离纯化

4．3．3 多糖纯化前后紫外光谱分析

4．3．4 多糖的理化性质

4．3．5 多糖分子量的测定

4．3．6 多糖的单糖组分分析

4．3．7 多糖的结构分析

4．4 本章小结

参考文献

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

攻读硕士学位期间发表的论文情况

致谢