吡唑硫磷雌激素效应及其斑马鱼胚胎发育毒性对映体选择性

摘要

近年来，典型手性有机磷杀虫剂吡唑硫磷的环境行为及急性毒性报道较多，但是关于其对鱼类等高等脊椎生物的水生毒性及内分泌干扰性的研究较少，更缺乏针对吡唑硫磷毒性的立体选择性差异研究。本研究运用体外重组人雌激素受体基因酵母菌并结合分子模拟方法，从分子水平上分析了吡唑硫磷的类雌激素效应的对映体选择性差异可能的分子机制;并以斑马鱼为实验模型，研究了免疫分子介导的吡唑硫磷水生发育毒性的对映体选择性。具体研究内容分述如下:
　　(1)引入计算机分子对接技术评价有机磷农药的类雌激素效应。选取10种报道有潜在雌激素活性的有机磷农药。通过分子对接方法研究表明:各有机磷农药分子与雌激素受体α(Estrogen Receptorα，ERα)配体结合域(Ligand Binding Domain，LBD)，ERβ LBD氨基酸存在不同的氢键作用、疏水作用和静电作用。这10种有机磷农药分子与ER受体不同的相互作用是导致它们雌激素效应差异的重要原因之一。
　　(2)采用重组人雌激素受体基因酵母菌评价吡唑硫磷的雌激素效应对映体选择性。结果表明:吡唑硫磷对映异构体具有对映体选择性的类雌激素活性，R构型显著大于S构型和外消旋体。分子对接结果显示:R构型与ERα LBD形成两个氢键，S构型与ERα LBD形成一个氢键;此外不同对映体与ER静电作用和疏水作用也存在结合模式。这可能是造成吡唑硫磷类雌激素活性差异对映体选择性的原因。
　　(3)以斑马鱼为模型生物，研究吡唑硫磷外消旋体和对映体水生发育毒性。实验结果表明:吡唑硫磷对斑马鱼幼鱼-胚胎急性毒性的致死效应大小顺序为:R＞rac＞S;吡唑硫磷能够诱导斑马鱼产生孵化抑制、卵黄囊水肿、心包囊水肿以及身体弯曲等多种发育异常，且R构型致畸效应显著大于S构型;吡唑硫磷对斑马鱼早期发育先天性免疫系统相关基因白介素(Interleukin，IL) IL-1β具有较明显的选择性上调作用，表现为R＞S。进一步，通过分子对接方法模拟表明:R/S构型与IL-1β受体LBD结合形成氢键个数不同，可能是导致选择性诱导的原因之一。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 有机磷类农药

1．2．1 有机磷类农药现状

1．2．2 吡唑硫磷农药手性特征

1．2．3 手性农药的绝对构型判断

1．3 手性农药水生毒性评价

1．3．1 农药水生毒性评价中的模式生物

1．3．2 斑马鱼在毒理学中的应用优势

1．3．3 手性有机磷农药水生毒性研究进展

1．4 手性农药内分泌干扰效应评价

1．4．1 手性农药内分泌干扰效应的研究进展

1．4．2 内分泌干扰效应的检测方法

1．5 分子对接

1．5．1 分子对接概况

1．5．2 分子对接在环境毒理学上的应用

1．6 本课题的选题依据及研究内容

第二章 ERα和ERβ介导的有机磷农药雌激素效应差异分析

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 分子对接

2．2．2 LogKow计算

2．2．3 ESP计算

2．3 结果与分析

2．3．1 LogKow分析

2．3．2 ERα与ERβ结构差异分析

2．3．3 结合模式分析

2．3．4 有机磷农药分子表面静电势

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 吡唑硫磷内分泌干扰的对映体选择性

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 药品与试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 吡唑硫磷对映体分离及绝对构型判断步骤

3．2．4 重组基因酵母实验步骤

3．2．5 分子对接

3．3 数据处理及统计分析

3．4 结果与讨论

3．4．1 吡唑硫磷对映体制备

3．4．2 吡唑硫磷对映体绝对构型判定

3．4．3 吡唑硫磷农药类雌激素效应对映体选择性

3．4．4 吡唑硫磷对映体与ERα结合模式分析

3．5 本章小结

第四章 免疫分子介导的吡唑硫磷斑马鱼胚胎发育毒性对映体选择性

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 药品与试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 实验步骤

4．2．4 同源模建

4．2．5 分子对接

4．3 统计分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 斑马鱼胚胎-幼鱼急性毒性对映体选择性

4．4．2 吡唑硫磷外消旋体发育毒性

4．4．3 吡唑硫磷对映体斑马鱼胚胎-幼鱼发育毒性对映体选择性

4．4．4 吡唑硫磷对映体斑马鱼胚胎-幼鱼免疫毒性对映体选择性

4．4．5 分子对接模拟吡唑硫磷对映体与斑马鱼IL-1β蛋白作用

3．5 小结

第五章 研究总结及未来工作展望

5．1 研究结果

5．1．1 ERα和ERβ介导的有机磷农药雌激素效应差异分析

5．1．2 吡唑硫磷内分泌干扰的对映体选择性

5．1．3 吡唑硫磷对斑马鱼胚胎发育毒性和免疫毒性的对映体选择性

5．2 研究展望

5．2．1 关注吡唑硫磷低剂量效应及代谢产物毒性效应

5．2．2 加强吡唑硫磷早期发育毒性及对映体选择性研究

5．2．3 进一步研究吡唑硫磷对斑马鱼早期发育的免疫毒性

5．2．4 计算毒理学在未来的应用

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文