胚胎早期毒死蜱暴露对小鼠海马脑区发育的影响

摘要

动物胚胎期更容易受到环境毒素如有机磷农药的影响，为探讨这一问题，我们在小鼠胚胎期E7.5～11.5暴露有机磷农药毒死蜱(chlorpyrifos，CPF)，用药剂量为0，1，5mg/kg/day，创建胚胎早期染毒模型。对染毒鼠的性别和脑内乙酰胆碱酯酶活力进行测定;对重要的认知行为中枢海马脑区的神经元与胶质细胞进行统计，测定时间选取为E12、E15和E18三天;通过连续组织切片与计算机三维重构方法对海马脑区的立体形态进行重塑。
　　研究结果表明:在胚胎早期E7.5～11.5天暴露CPF，在两种CPF处理剂量下的胚胎脑胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活力受到了一定的影响。在E12天，1mg/kg与5mg/kg CPF处理后雌性胚胎脑AChE分别降至对照组的77.88±6.55％(p＜0.05)和62.95±6.45％(p＜0.05);雄性胚胎脑AChE降至对照组的80.48±6.85％(p＜0.05)和66.52±5.96％(p＜0.05)，5mg/kg CPF暴露毒性作用明显强于1mg/kg组，但两种性别之间无明显统计学差异(p＞0.05)。在E15天，1mg/kg与5mg/kg CPF处理后雌性胚胎脑AChE降至对照组的87.10±8.70％(p＞0.05)和78.00±5.69％(p＞0.05);雄性胚胎脑AChE活力分别降至对照组的87.10±8.70％(p＞0.05)和78.00±5.69％(p＞0.05)，两种性别之间无明显统计学差异(p＞0.05)。在E18天，1mg/kg与5mg/kg CPF处理后雌性胚胎脑AChE为对照组的99.79±13.78％(p＞0.05)和85.46±9.03％(p＞0.05);雄性胚胎脑AChE为对照组的95.06±23.31％(p＞0.05)和87.73±8.56％(p＞0.05)，两种性别之间无明显统计学差异(p＞0.05)。即胚胎期暴露毒死蜱造成脑AChE活力抑制，这种抑制作用随时间延伸可以恢复，在胚胎脑这种毒性作用没有性别差异。
　　对胚胎脑海马神经元和胶质细胞数量的研究结果发现，1mg/kgCPF暴露，造成E12天海马原基胶质细胞(p＜0.05)和神经元数量(p＜0.05)均有降低;E15天海马CA1的胶质细胞(p＜0.05)和神经元(p＜0.05)均有降低，CA3的胶质细胞降低(p＜0.05)而神经元无明显统计学差异(p＞0.05);E18天，海马CA1、CA3和DG区胶质细胞(p＞0.05)和神经元(p＞0.05)数量均无统计学差异。5mg/kg CPF暴露，使E12天海马原基胶质细胞(p＜0.05)和神经元数量(p＜0.001)明显减少;在E15天，海马CA1和CA3区胶质细胞(p＜0.01)和神经元(p＜0.01)数量明显减少。在E18天，海马CA1、CA3和DG区胶质细胞(p＜0.05)和神经元数量(p＜0.05)仍有减少。
　　对E18脑海马区域进行连续切片，经3D-doctor软件处理，重构出三维立体脑结构。数据分析表明，Control组海马和截面coronal7-coronal19体积分别为0.36.μm3和5.31μm3，CPF组海马和截面coronal7-coronal19体积分别为0.35μm3和5.24μm3。
　　综合研究结果表明，(1)CPF造成的胆碱酯酶活力抑制有一定的可恢复性;(2)CPF的毒性作用无明显胚胎性别间的差异;(3)CPF对胚胎海马的胶质细胞和神经元数量均有抑制作用，这种作用可持续至已停止染毒的E18天;(4)CPF处理下，海马宏观结构没有明显影响。

目录

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摘要

主要缩略词一览表

第一章 综述

1．1 引言

1．2 有机磷农药的神经毒性

1．2．1 有机磷农药影响神经递质代谢

1．2．2 有机磷农药对认知功能的影响

1．2．3 有机磷农药对不同性别的影响

1．3 海马的结构及发育

1．3．1 海马的结构

1．3．2 海马的发育

1．4 脑与三维重构技术

1．5 研究创新点及意义

第二章 毒死蜱对胚胎脑乙酰胆碱酯酶活性的影响

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验仪器

2．2．3 实验试剂

2．2．4 实验试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 实验动物及处理

2．3．2 胚胎样品处理及蛋白质含量测定

2．3．3 胚胎性别的测定

2．3．4 胆碱酯酶活力测定

2．3．5 统计分析

2．4 实验结果

2．4．1 蛋白含量标准曲线

2．4．2 小鼠胚胎基因组DNA提取及PCR扩增

2．4．3 CPF处理对胚胎脑胆碱酯酶活力的影响

2．4．4 CPF作用的性别差异

2．5 本章小结

第三章 毒死蜱对胚胎脑海马神经细胞发育的影响

3．1 前言

3．2 实验仪器与试剂

3．2．1 实验仪器和耗材

3．2．2 实验试剂

3．2．3 试剂配制

3．3 实验方法

3．3．1 实验动物及处理

3．3．2 胚胎制备与固定

3．3．3 石蜡包埋

3．3．4 石蜡切片

3．3．5 Niss1染色

3．2．6 各时期海马形态学观察及计数

3．3．7 统计分析

3．4 结果与讨论

3．4．2 CPF对E12海马原基细胞的影响

3．4．3 CPF对E15海马原基细胞的影响

3．4．4 CPF对E18海马原基细胞的影响

3．4．5 不同时间点海马形态的发育变化

3．5 本章小结

第四章 毒死蜱对胚胎脑海马三维结构的影响

4．3．3 石蜡包埋

4．3．4 石蜡切片

4．4．2 创建图片的手动配准模板

4．4．3 将拍摄图片转化成小内存的灰度图片

4．4．5 利用灰度图片进行三维重构

4．4．6 重构后海马和所在脑截面的参数结果

4．4．7 CPF对E18海马总体积的影响

4．5 本章小结

参考文献

致谢

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