S层蛋白包覆脂质体作为口服疫苗载体的研究

摘要

阳离子脂质体在药物递送系统中具有较大的应用价值，细菌的表层蛋白即S层蛋白(Slps)，由于具有独特的自组装性能，离体后能在界面自组装排列，用于包覆阳离子脂质体可提高脂质体的稳定性和增加胃肠道粘附性，可作为较好的口服疫苗载体。但Slps与阳离子脂质体之间的相互作用和Slps包覆的脂质体作为口服疫苗载体的应用都鲜有报道。
　　本文从瑞士乳杆菌中提取Slps，以纯度和浓度为标准比较三种变性剂对Slps的提取，最终确定使用5M的氯化锂提取Slps。采用物理混合方法，将Slps稀释成不同浓度包覆于Eudragit(@)RL100和N，N-二甲基-(N'，N'-双(硬脂酰基-1-乙基)）1，3-丙二胺(DMSP)制备的两种阳离子脂质体上。通过测定Slps包覆两种阳离子脂质体的电位粒径的变化和观察脂质体的透射电镜图，以反应两者相互作用的动态过程。发现脂质体随着Slps的不断加入，Eudragit(@)RL100制备的阳离子脂质体电位从+51.6±2.3mV逐渐降至+14.6±0.8mV，DMSP制备的阳离子脂质体电位从+50.8±2.1mV逐渐降至+39.7±2.4mV，都发生了显著降低。但Eudragit(@)RL100制备的阳离子脂质体的粒径(158.0±2.1nm)和DMSP制备的阳离子脂质体的粒径(180.8±10.3nm)几乎未改变。
　　为考察Slps包覆脂质体的性能，本文首先制备荧光脂质体，测定Slps对荧光脂质体淬灭效应的阻滞作用，以证明Slps包覆于脂质体表面。通过制备硬脂胺-异硫氰基荧光素嫁接物，将其与脂质体高温混合，加入不同浓度碘化钾，发现荧光脂质体被Slps包覆之后，Eudragit(@)RL100阳离子脂质体对碘化钾的荧光淬灭阻滞作用增加了约7.85％～56.29％，DMSP阳离子脂质体对碘化钾的荧光淬灭阻滞作用增加了约9.96％～89.97％。然后利用红外光谱(FTIR)考察Slps包覆脂质体的作用力，比较Slps包覆阳离子脂质体的冻干粉、Slps和阳离子脂质体冻干粉物理混合物之间的红外光谱，发现两者谱图几乎一致，说明Slps包覆的脂质体与物理混合物一样是非共价键的相互作用。最后通过小鼠灌胃实验，观察到Slps包覆的两种阳离子脂质体都能增加脂质体对小鼠胃肠道黏膜的粘附性。
　　以乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）为模型药物以考察Slps包覆阳离子脂质体作为口服疫苗载体的效果。首先确定双波长G250法为脂质体包封率的测定方法，然后采用逆相蒸发法制备粒径561.2nm、电位24±0.36mV和疫苗包封率约85.3％的Slps包覆载疫苗阳离子脂质体（总脂质与乙肝疫苗质量浓度比为100∶1，与Slps质量浓度比为5∶1）。通过分别给小鼠注射乙肝疫苗、口服乙肝疫苗、口服载乙肝疫苗阳离子脂质体和口服Slps包覆的载乙肝疫苗阳离子脂质体，于第8周、第10周和第12周取小鼠血清，采用小鼠免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定不同剂型刺激机体产生的IgG抗体水平。结果发现乙肝疫苗口服组几乎无效果，脂质体包载的乙肝疫苗口服组和Slps包覆载乙肝疫苗的脂质体口服组能改善乙肝疫苗的直接口服，刺激了机体更多地产生IgG，其中Slps包覆载乙肝疫苗的脂质体口服组诱导小鼠产生的IgG水平最高，但其免疫效果和注射组还是存在一些差距。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词简表(Abbreviations)

前言

第一章 S层蛋白的提取

1．1 仪器与试药

1．1．1 仪器

1．1．2 试药

1．2 方法

1．2．1 MRS培养基配制

1．2．2 细菌生长曲线的绘制

1．2．3 蛋白浓度测定方法的确定

1．2．5 Slps提取工艺考察

1．3 结果与讨论

1．3．1 瑞士乳杆菌生长曲线

1．3．2 蛋白浓度测定方法的确定

1．3．3 S层蛋白提取方法的确定

1．4 本章小结

第二章 Slps包覆阳离子脂质体的性能评价

2．1 仪器与试药

2．1．1 仪器

2．1．2 试药

2．2 方法

2．2．1 阳离子脂质体的制备

2．2．3 Slps-阳离子脂质体的透射电镜图

2．2．4 Slps-阳离子脂质体的去淬灭效应

2．2．5 红外光谱的测定

2．2．7 Slps包覆阳离子脂质体的胃肠道黏附性的研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 Slps-阳离子脂质体电位粒径的变化

2．3．2 Slps-阳离子脂质体形态表征

2．3．3 Slps-荧光脂质体的去淬灭效应

2．3．4 Slps与阳离子脂质体的相互作用力

2．3．5 Slps包覆脂质体的胃肠道黏附性

2．4 本章小结

第三章 Slps包覆阳离子脂质体作为口服乙肝疫苗载体

3．1 仪器与试药

3．1．1 仪器

3．1．2 试药

3．2 方法

3．2．1 低浓度蛋白测定方法的确定

3．2．2 DLP载乙肝疫苗制备方法的确定

3．2．3 S-DLP载乙肝疫苗的评价

3．3 结果与讨论

3．3．1 低浓度蛋白测定方法的确定

3．3．2 DLP载乙肝疫苗制备方法的确定

3．3．3 S-DLP载乙肝疫苗的评价

3．4 本章小结

全文总结

参考文献

综述 S层蛋白包覆脂质体作为药物载体的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文和专利