农杜菌介导无标记耐盐基因水稻高效转化系统的建立

摘要

全世界盐碱地面积约占世界总耕地面积的20％。由于干旱，不合理的灌溉以及化肥的过度使用，工业污染加剧，土壤盐碱化正不断扩大，可供耕种的土地面积正日趋减少。水稻是世界1/3人口的主食，但一直处于供不应求的状况，因此，提高水稻产量，改良稻米品质关系到人类的生存和发展。在盐碱地区，利用转基因手段来获得高耐盐的转基因水稻，推广具有广泛适应性的水稻耐盐优异品种，是开辟盐碱荒地和水稻增产的一个新增长点，目前运用最广泛的转基因水稻方法之一是农杆菌介导转化法。研究建立农杆菌介导耐盐基因高效水稻转化系统具有重要理论和实际指导意义。根据外源基因是耐盐基因的特点，建立农杆菌介导无选择标记耐盐基因水稻转化系统对转基因水稻商品化应用具有重大意义，避免了抗性标记基因可能存在对食品和生态环境的潜在危害。
　　 制约农杆菌介导转化水稻效率的主要因素是周期长和转化受体的状态。本文从这两方面入手，建立高效农杆菌介导转化水稻系统。根据外源基因是耐盐基因，探讨NaCl作为筛选剂可行性，但传统确定NaCl筛选浓度需要绘制NaCl浓度梯度对愈伤组织增重率之间的生长曲线。此过程比较繁琐且容易造成污染和误差。探讨利用NaCl对水稻种子发芽率的抑制效果作为确定水稻耐盐基因转化中愈伤组织筛选所需NaCl使用浓度的可行性，同时比较NaCl与潮霉素的筛选效果。最后，将两者有机结合，对不同类型的耐盐基因进行农杆菌介导无标记高效转化水稻，证明该系统是完全可行和有效的。主要实验结果如下：
　　 (1)快速诱导水稻愈伤组织的建立
　　 在32℃暗培养7天诱导水稻愈伤组织的快速诱导系统，日本晴、秀水11、，春江06的出愈率均在60％以上，分别是92.87％、82.63％、64.83％;在28℃光培养7天诱导水稻愈伤组织的快速诱导系统，日本晴、秀水11、春江06的出愈率均在70％以上，分别是95.5％、93.07％、74.87％。愈伤表面突起，呈淡黄色，具有活力，完全符合转化的要求，从传统的愈伤组织诱导需要15天缩短到7天。
　　 (2)高效农杆菌介导转化水稻的建立
　　 采取热激处理，中华11、秀水11、春江06转化效率提高率分别在58.50％、21.96％、27.85％;液体共培养感染，三种水稻转化率提高有60.57％、23.54％、25.17％，建立高效农杆菌介导转化水稻。
　　 (3)简便获得NaCl有效筛选浓度法的建立
　　 根据常规的NaCl浓度梯度对愈伤组织增重率之间的生长曲线，确定愈伤组织增重抑制率为80％左右的NaCl浓度为合适的筛选浓度，此相应NaCl浓度对四个品种水稻种子的发芽抑制率均达50％以上。因此，可选取对水稻种子的发芽抑制率达50％以上的NaCl浓度作为耐盐基因转化中筛选时NaCl有效浓度的重要参考。
　　 (4)证明转化耐盐基因中NaCl筛选的有效性和可行性
　　 根据选取的外源基因为耐盐基因，以NaCl作为筛选剂，达到了筛选的目的，对中华11来说，NaCl筛选下转化率为11.98％，潮霉素筛选下转化率为14.43％;对秀水11来说，NaCl筛选下转化率为32.06％，潮霉素筛选下转化率为42.64％;对春江06来说，NaCl筛选下转化率为32.03％，潮霉素筛选下转化率为41.39％，说明NaCl筛选效果与潮霉素筛选相近。
　　 (5)安全高效农杆菌介导转化水稻的建立
　　 采用NaCl筛选与高效农杆菌介导转化水稻相结合，发现秀水11转化效率提高率29.9％，建立安全高效农杆菌介导转化水稻。
　　 (6)证明安全高效农杆菌介导耐盐基因转化日本晴的可行性和有效性
　　 选取不同耐盐机制的耐盐基因，将其作为外源基因采用建立的农杆菌介导无选择标记耐盐基因高效转化水稻系统对日本晴进行转化，实验表明：BADH、CMO、PKCC的转化效率均在40％以上，分别是44.03％、46.29％、44.68％，证明农杆菌介导无标记耐盐基因高效转化日本晴是可行和有效的。
　　 综上所述，安全，快速，高效的农杆菌介导耐盐基因转化水稻系统已经建立。即32℃光培养7天后，进行43℃水浴30min，冰浴1min，移至事先浸润液体共培基的三层滤纸上暗培养2天，转至含盐筛选培养基，进行筛选，植株再生的水稻转化系统。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 水稻遗传转化的研究进展

1.1.1 水稻遗传转化的历史

1.1.2 水稻遗传转化方法概述

1.1.3 小结

1.2 农杆菌介导转化水稻机理及影响因素

1.2.1 转化机理

1.2.2 农杆菌介导转化植物的影响因素

1.2.3 农杆菌介导转化高效转化系统研究的意义

1.3 水稻盐害机理及耐盐基因工程研究进展

1.3.1 盐害

1.3.2 植物耐盐机理及其相关基因

1.3.3 植物甜菜碱合成基因工程研究进展

1.3.4 HKT基因工程研究

1.3.5 当前水稻耐盐基因工程存在的问题

1.4 本论文研究思路与主要研究内容

第二章 水稻愈伤组织快速诱导的研究

2.1 引言

2.2 材料、试剂与实验仪器

2.2.1 材料

2.2.2 试剂

2.2.3 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 水稻种子消毒接种

2.3.2 水稻愈伤组织的诱导

2.3.3 数据处理

2.4 实验结果和分析

2.4.1 光照对水稻愈伤组织诱导的影响

2.4.2 温度对水稻愈伤组织诱导的影响

2.5 讨论

第三章 提高农杆菌介导转化水稻效率的研究

3.1 引言

3.2 材料、试剂与实验仪器

3.2.1 材料

3.2.2 试剂

3.2.3 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 常规农杆菌介导法

3.3.2 热激处理愈伤对水稻转化效率的影响

3.3.3 液体共培养对水稻转化效率的影响

3.3.4 氯化钙预培养对水稻转化效率的影响

3.3.5 转基因植株的分子鉴定

3.3.6 数据处理

3.4 结果与分析

3.4.1 热激处理对农杆菌转化效率的影响

3.4.2 液体共培养对农杆菌转化效率的影响

3.4.3 预培养对农杆菌转化效率的影响

3.5 讨论

第四章 种子发芽抑制法选择NaCl筛选浓度的研究

4.1 引言

4.2 材料、试剂与实验仪器

4.2.1 材料

4.2.2 试剂及培养基

4.2.3 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 种子消毒

4.3.1 NaCl抑制发芽试验

4.3.2 愈伤组织诱导继代

4.3.3 NaCl抑制愈伤生长试验

4.3.4 数据处理

4.4 实验结果和分析

4.4.1 不同浓度NaCl对水稻种子发芽的抑制

4.4.2 不同浓度NaCl对水稻愈伤组织生长的抑制

4.4.3 不同浓度NaCl对水稻愈伤组织生长的抑制与种子发芽抑制的相关性

4.5 讨论

第五章 NaCl与潮霉素筛选对水稻耐盐基因转化效果比较

5.1 引言

5.2 材料、试剂与实验仪器方法

5.2.1 材料

5.2.2 试剂及培养基

5.2.3 实验仪器

5.3 实验方法

5.3.1 农杆菌介导转化水稻

5.3.2 转基因植株的分子鉴定

5.3.3 数据处理

5.4 实验结果和分析

5.5 讨论

第六章 热激和液体共培养提高NaCl筛选耐盐基因转化水稻效率的研究

6.1 引言

6.2 材料、试剂与实验仪器

6.2.1 材料

6.2.2 试剂及培养基

6.2.3 实验仪器

6.3 实验方法

6.3.1 农杆菌介导法

6.3.2 热激处理愈伤对水稻转化效率的影响

6.3.3 液体共培养对水稻转化效率的影响

6.3.4 热激与液体共培养协同处理对水稻转化效率的影响

6.3.5 转基因植株的分子鉴定

6.3.6 数据处理

6.4 结果与分析

6.4.1 热激处理对NaCl筛选PKCC转化水稻效率的影响

6.4.2 液体共培养对NaCl筛选PKCC转化水稻效率的影响

6.4.3 热激和液体共培养对NaCl筛选PKCC转化水稻效率的影响

6.5 讨论

第七章 NaCl筛选对不同耐盐基因转化水稻的影响

7.1 引言

7.2 材料、试剂与实验仪器

7.2.1 材料

7.2.2 试剂

7.2.3 实验仪器

7.3 实验方法

7.3.1 农杆菌介导转化水稻

7.3.2 转基因植株的PCR检测

7.3.3 数据处理

7.4 实验结果与分析

7.5 讨论

第八章 转基因植株的耐盐生理生化检测

8.1 引言

8.2 材料、试剂与实验仪器

8.2.1 材料

8.2.2 试剂

8.2.3 实验仪器

8.3 实验方法

8.3.1 叶绿素含量的测定

8.3.2 丙二醛的测定

8.3.3 脯氨酸含量的测定

8.4 实验结果与分析

8.4.1 叶绿素含量的测定

8.4.2 丙二醛的测定

8.4.3 脯氨酸含量的测定

8.5 讨论

第九章 结论

参考文献

附录A 部分试剂及培养基配制

附录B 培养基母液的配制

附录C 缩略词汇表

攻读学位期间发表的论文

致谢