植物乳杆菌ZJ316黏附蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要

乳酸菌是人和动物肠道内的优势微生物菌群，益生性的乳酸菌在机体内有调节人和动物体微生态平衡，抑制并杀死致病菌，增强机体免疫力的作用。黏附是乳酸菌定植于宿主肠道发挥各种生理作用的前提。研究乳酸菌的黏附机制对于微生态制剂的开发应用具有重要的研究意义。
　　 本研究以本实验室保存的从婴儿粪便中筛选得到的一株产细菌素的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ZJ316）为研究对象。采用微生物黏着碳氢化合物法(MATH)测定了三株乳酸菌（植物乳杆菌ZJ316、植物乳杆菌ZJ22、屎肠球菌ZJ19）疏水性、表面电荷和自聚合能力等表面性质，并且进行了酵母凝集实验测定乳酸菌的糖类专一性。结果显示，植物乳杆菌ZJ316的疏水性最高(83.67±1.13)。酵母凝集实验表明植物乳杆菌ZJ316的酵母凝集度为32，加入了D-甘露糖和甲基-α-D-甘露糖苷的的实验组，乳酸菌的黏附力下降，说明植物乳杆菌（Lactobacillus plantarumZJ316）的黏附与特异性黏附中的甘露糖结合相关联。
　　 以Lactobacillus plantarum WCFS1表层黏附蛋白Slp2588、黏液黏附蛋白Muc2486黏附蛋白基因序列(1062815)、(1062646)进行引物设计，在Lactobacillus plantarumZJ316中，克隆黏附基因并进行测序。测序结果为:基因片段slp2588A长度为1618 bp，基因片段muc2486A长度为3018 bp。在NCBI网站用BLAST软件相似性比较，结果显示，基因片段slp2588A和Lactobacillus plantarum WCFS1中的黏附基因slp2588相似性为98％;基因片段muc2486A和L.plantarumWCFS1中的黏附基因muc2486相似性为99％。因此，我们初步判断在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZJ316基因组中存在表层黏附蛋白Slp2588和粘液黏附蛋白Muc2486基因序列。
　　 将含有相同黏性末端的目的片段（slp2588A、muc2486A）与质粒载体(pET-28a)体外重组构建原核表达载体。将重组载体转入BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示有目的蛋白条带。离心收集重组体菌体，超声波破碎离心，发现沉淀中含有目的蛋白，说明目的蛋白以包含体的形式表达，没有活性，需要复性才能分离纯化。将两个目的蛋白的包含体进行酵母凝集实验，发现酵母凝集能力更强。说明构建大肠杆菌BL21(DE3)原核表达载体异源表达的表面黏附蛋白Slp2588和黏液黏附蛋白Muc2486在植物乳杆菌ZJ316的黏附中起着重要的作用。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 益生菌的概述

1．1．1 益生菌的定义及分类

1．1．2 益生菌的研究现状

1．1．3 益生菌的作用机理及应用

1．2 乳酸菌的黏附作用研究进展

1．2．1 乳酸菌概述

1．2．2 乳酸菌对人体的益生作用

1．2．3 乳酸菌的作用机理

1．2．4 乳酸菌的黏附性研究意义及进展

1．3 乳酸菌的黏附作用机理

1．3．1 乳酸菌类黏附机制

1．3．2 肠液黏蛋白模型

1．3．3 肠道中参与黏附的受体

1．3．4 黏附的生物学效应

1．3．5 乳酸菌黏附作用的特点

1．3．6 乳酸菌黏附实验方法

1．4 研究思路及研究内容

1．4．1 研究思路

1．4．2 研究内容

第二章 植物乳杆菌ZJ316的酵母凝集试验和自身表面性质的测定

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 主要试剂与培养基

2．1．3 主要设备与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的活化培养

2．2．2 菌悬液的制备

2．2．3 细菌表面性质的测定

2．2．4 乳酸菌自聚合能力的测定

2．2．5 酵母凝集度的测定

2．2．6 数据分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 乳酸菌表面性质

2．3．2 乳酸菌的自聚合能力

2．3．3 乳酸菌对酿酒酵母的凝结能力

2．4 本章小结

第三章 植物乳杆菌ZJ316黏附基因slp2588A、muc2486A的克隆

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂与培养基

3．1．2 载体及菌株

3．1．3 主要仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 黏附基因的选择和引物的设计

3．2．2 植物乳杆菌ZJ316的活化、培养

3．2．3 植物乳杆菌ZJ316基因组的提取和电泳检测

3．2．4 PCR扩增DNA片段及电泳检测

3．2．5 大肠杆菌感受态细胞的制备

3．2．6 PCR产物的纯化

3．2．7 连接

3．2．8 重组质粒的转化

3．2．9 转化子的筛选及菌种保藏

3．2．10 重组子的鉴定：质粒的提取及酶切、电泳检测

3．2．11 扩增片段基因的测序与序列分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 slp2588A和muc2486A基因片段的扩增

3．3．2 PCR产物的纯化

3．3．3 阳性转化子的筛选及重组子的鉴定

3．3．4 扩增片段的基因序列测序

3．4 本章小结

第四章 植物乳杆菌ZJ316黏附基因slp2588A、muc2486A原核表达载体的构建与表达及功能研究

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂与培养基

4．1．2 试剂

4．1．3 基因工程载体及菌株

4．1．4 主要仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 大肠杆菌原核表达载体的构建

4．2．2 重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)的诱导表达

4．2．3 SDS-PAGE电泳

4．2．4 重组蛋白表达形式的鉴定

4．2．5 包含体获得以及酵母凝集实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 PCR扩增基因片段及pET-28a质粒的提取

4．3．2 PCR产物的纯化

4．3．3 目的片段及pET-28a质粒沉淀回收

4．3．4 阳性转化子的筛选及重组的鉴定

4．3．5 表达载体BL21(DE3)中阳性转化子的筛选

4．3．6 重组体的测序结果

4．3．7 SDS-PAGE

4．3．8 重组蛋白表达形式的鉴定

4．3．9 包含体的酵母凝集实验

4．4 本章小结

第五章 结论

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

附录A 部分培养基配方

附录B 部分有机化学试剂配方

附录C 测序结果

致谢

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