铜在饮水和饮食条件下对小鼠生理效应的影响及其机理研究

摘要

铜是人体必需的营养元素，过量的铜会对健康造成危害，铜的吸收及毒性与其存在形态密切相关。人体中铜的主要来源为饮食与饮水，然而不同摄入方式下铜对生物体生理学效应的影响差异却鲜有报道。本文以雄性ICR小鼠为试验动物模型，研究不同方式下摄入的铜对小鼠氧化应激、血清铜等生理参数及其十二指肠Ctr1、ATP7A等基因转录水平的影响;通过体外模拟消化研究铜与食品组（成）分的相互作用，及铜在不同摄入方式下的生物可接受度、络合态和离子态的变化;以Caco-2和HepG2细胞为模型探讨离子态与络合态铜的转运通路。取得了以下主要试验结果:
　　(1)铜的不同摄入方式对小鼠生长及生理参数的影响。将72只雄性ICR小鼠随机分为6组，分别以饮食或饮水的方式摄入生理需要量(6ppm)或过量(15、30ppm)的硫酸铜。经过三个月的饲喂，饮水组小鼠体重增长速率显著低于饮食组(p＜0.05)，肝脏谷胱甘肽含量随铜浓度的升高呈梯度性下降（分别为饮食组的81％、68％及59％，p＜0.05），超氧化物歧化酶活力也仅有饮食组的87～91％(p＜0.05)，血清非铜蓝蛋白结合铜（自由铜）升高为同剂量饮食组的124％，129％及169％(p＜0.05)。不同摄入方式下，小鼠肝、脾、肾、脑的铜含量无显著梯度性差异(p＞0.05)，但在生理需要量的铜(6ppm)饲喂下，饮水组小鼠脑部可溶性β样淀粉蛋白1-42(Aβ1-42)的含量相比同剂量饮食组上升了30％(p＜0.05)。试验说明，在等于或高于生理需要量时，饮水摄入的铜会抑制小鼠生长，增加其肝脏的氧化损伤、增加血清中自由铜和脑中可溶性Aβ1-42的含量，有可能增加其罹患阿尔茨海默病的风险。
　　采用荧光定量PCR考察小鼠十二指肠铜转运相关基因的表达水平。研究发现，在铜的不同摄入方式与摄入浓度下，小鼠Ctr1与DMT1的mRNA水平无明显变化(p＞0.05)。ATP7A，MT mRNA水平在饮水组不同铜浓度下无明显差异(p＞0.05)，在饮食组中随着铜浓度的增加梯度性上升，30ppm时显著高于6ppm(p＜0.05)，显著高于同剂量饮水组(p＜0.05)。饮食组小鼠肝脏MT蛋白含量在15ppm和30ppm浓度下也显著高于同剂量饮水组(p＜0.05)。
　　(2)模拟消化环境及不同食品组（成）分添加下，膳食铜（硫酸铜）的溶解度及电势变化。试验得到在空白消化液中，随着pH值的升高氢氧化铜沉淀逐渐形成，铜离子电势降低，pH7.5时铜的溶解度为1.4±0.4mg/L，显著高于水中铜的溶解度(0.3±0.2mg/L，p＜0.05)。当在体系中添加葡萄糖、蔗糖、果糖时，铜离子电势变化与空白/消化液中类似，铜的溶解度低于3％。当在消化液中添加有机酸或氨基酸组分时，随着环境pH值的升高，添加的成分逐渐与铜形成可溶性络合物，铜溶解度达到95％以上，铜离子电势明显低于空白/消化液体系(p＜0.05);当添加酪蛋白、消化酶等物质时，铜会与其形成大小不同的络合物，铜的溶解度与配体的大小呈负相关。试验说明铜具有较强络合能力，与食糜的反应符合广义路易斯酸碱理论，并受到酸效应的影响;消化道中铜的溶解度和铜离子的浓度取决于环境的pH值和食糜的组成。
　　(3)体外模拟消化条件下不同饮食铜源（硫酸铜、氨基酸铜和蛋白铜）的生物可接受度、大小分布和离子活度变化。饮水摄入时，三种类型铜盐（硫酸铜、氨基酸铜和蛋白铜）在模拟肠道所形成的化合物分子量主要分布在100Da～1kDa，生物可接受度为硫酸铜81±2％、氨基酸铜79.5±0.3％、蛋白铜76±7％;空腹饮水时，2mg/L的无机铜在100Da～1kDa的分布比例达到90±3％，生物可接受度为96±1％。当通过饮食摄入时，食品中的大分子物质及聚合物会与铜发生络合，100Da～1kDa的分布减少，10kDa以上的分布比例增加，铜的生物可接受度显著下降（硫酸铜48±5％、氨基酸铜63±5％、蛋白铜60±4％，p＜0.05）。饮水摄入时，铜的离子电势也显著高于饮食摄入(p＜0.05):空腹饮水摄入时三种铜的离子电势均高于280mV，饮水摄入时电势分别为178±3、167±3及163±2mV，而饮食摄入时，电势仅为148±2、149±2及136±2mV。试验结果说明消化时各类有机物质会竞争性的与铜发生络合，相比饮食摄入，饮水摄入的铜在肠道中形成的化合物平均分子量小，生物可接受度和铜离子浓度均更高。
　　(4)离子态和络合态铜在Caco-2细胞及HepG2细胞中的转运通路研究。Caco-2细胞在2μmol/L和6μmol/L的铜中孵育5～30min，离子态铜孵育的细胞铜含量均显著高于络合态铜组(p＜0.05);当加入二价离子通路抑制剂（锌离子）时，离子态铜组细胞铜含量降低为对照组的77％(p＜0.05)，而络合态铜组无明显变化;Ctr1通路抑制剂（银离子及卡铂）的加入对两种铜孵育的Caco-2细胞均无显著影响。在HepG2细胞中，低浓度和短时间的铜孵育（离子态和络合态铜）对细胞内铜含量无显著影响;当加入锌离子时，细胞内铜含量（离子态和络合态铜组）相比对照组均无明显变化;银离子及卡铂的加入显著降低了细胞对离子态和络合态铜的吸收(p＜0.05)。6μmol/L的铜（离子态和络合态）孵育细胞5min，细胞活性氧水平及线粒体膜电位均无明显变化。根据试验结果可知:铜的存在形态（离子态和络合态）会影响其在肠道模型细胞（Caco-2细胞）的吸收，相比络合态，离子态的铜更容易被吸收;Caco-2细胞中存在一种易于转运离子态铜，能够被锌离子抑制的铜转运通路;肠道模型细胞和肝脏模型细胞（HepG2细胞）吸收铜的主要通路可能不同。
　　上述研究结果表明，铜通过饮水方式摄入时，相比饮食摄入具有更高的生物可接受度和离子活度，进入肠道细胞的通路也有所不同，对小鼠的毒性更大。当饮水提供生理需要量100％及以上的铜时，有可能导致铜的过量吸收并诱发潜在危害，应在现有标准基础上进一步限制饮用水中铜的含量。

目录

摘要

第1章 文献综述

1．1 铜与生物体的关系

1．1．1 铜的分布与应用

1．1．2 铜的吸收与转运

1．1．3 铜对生物体的作用

1．1．4 过量铜的危害

1．2 人体中铜的摄入来源

1．2．1 人体对铜的需要量及限量

1．2．2 铜的膳食标准限量

1．2．3 饮食对铜摄入的贡献

1．2．4 饮水对铜摄入的贡献

1．3 铜存在形态与其吸收及毒性的关系

1．3．1 金属的形态与其吸收及毒性的关系

1．3．2 不同来源的铜与吸收及毒性的关系

1．3．3 铜存在形态的测定方法

1．4 选题背景和主要研究内容

1．4．1 选题背景

1．4．2 主要研究内容

1．4．3 技术路线

第2章 铜的不同摄入方式对小鼠氧化应激、血清铜等生理参数及效应的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 仪器与设备

2．2．2 材料与试剂

2．2．3 动物饲养与试验设计

2．2．4 体重和样本收集

2．2．5 肝、脾、肾及脑中铜含量的测定

2．2．6 肝脏和脑中GSH、SOD、GSH-Px及MDA的测定

2．2．7 血清铜、铜蓝蛋白及血清自由铜的测定

2．2．8 脑中可溶性Aβ1-42的含量

2．2．9 数据统计

2．3．2 生长性能

2．3．3 肝、脾、肾和脑中的铜含量

2．3．4 肝脏与脑中GSH、SOD、GSH-Px及MDA

2．3．5 血清铜、血清自由铜

2．3．6 脑中可溶性Aβ1-42

2．4 讨论

2．4．1 生长效率与器官铜含量

2．4．2 氧化应激的变化

2．4．3 血清铜及血清自由铜的变化

2．4．4 脑中可溶性Aβ1-42含量的变化

2．5 本章小结

第3章 铜的不同摄入方式对小鼠十二指肠铜转运相关基因水平的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 仪器与设备

3．2．2 材料与试剂

3．2．3 小鼠肠道组织中RNA的提取与测定

3．2．4 cDNA制备与合成

3．2．5 PCR反应

3．2．6 肝脏中金属硫蛋白含量测定

3．2．7 数据统计

3．3 结果与分析

3．3．1 Ctr1、DMT1 mRNA水平

3．3．2 ATP7A mRNA水平

3．3．3 MT的表达

3．4 讨论

3．5 本章小结

第4章 体外模拟消化环境下试验铜与食品组(成)分的相互作用

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 仪器与设备

4．2．2 材料与试剂

4．2．3 模拟消化液的配置

4．2．4 试验设计

4．2．5 铜离子电势测定

4．2．6 铜及蛋白质溶解度测定

4．2．7 数据统计

4．3 结果与分析

4．3．1 水溶液与空白／消化液中的铜电势及溶解度变化

4．3．2 添加小分子组分消化液的铜电势变化

4．3．3 添加小分子组分消化液的铜溶解度

4．3．4 添加大分子组分消化液的铜电势变化

4．3．5 添加大分子组分消化液的铜溶解度

4．4 讨论

4．4．1 消化液中铜离子的价态

4．4．2 消化液中无机离子对铜溶解度的影响

4．4．3 胃肠道酸效应对铜络合反应的影响

4．4．4 食糜成分对铜络合反应及溶解度的影响

4．5 本章小结

第5章 不同摄入方式下试验铜的生物可接受度及电势变化

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 仪器与设备

5．2．2 材料与试剂

5．2．3 体外模拟消化

5．2．4 试验设计

5．2．5 生物可接受度

5．2．6 铜化合物大小原位分析

5．2．7 铜离子电势测定

5．2．8 数据统计

5．3 结果与分析

5．3．1 硫酸铜生物可接受度

5．3．2 氨基酸铜生物可接受度

5．3．3 蛋白铜生物可接受度

5．3．4 摄入硫酸铜时铜化合物大小分布

5．3．5 摄入氨基酸铜时铜化合物大小分布

5．3．6 摄入蛋白铜时铜化合物大小分布

5．3．7 试验铜的离子电势变化

5．4 讨论

5．4．1 铜的生物可接受度

5．4．2 铜离子活度

5．5 本章小结

第6章 离子态和络合态铜在Caco-2细胞及HepG2细胞中的转运通路研究

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 仪器与设备

6．2．2 材料与试剂

6．2．3 细胞试验

6．2．4 铜的离子态和络合态对铜转运的影响

6．2．5 二价离子通路抑制剂

6．2．6 Ctr1通路抑制剂

6．2．7 细胞转运通路稳定性

6．2．8 数据统计

6．3 结果与分析

6．3．1 孵育液中离子态和络合态铜的表征

6．3．2 离子态与络合态铜孵育下细胞中铜含量的变化

6．3．3 二价离子通路抑制剂

6．3．4 Ctr1通路抑制剂

6．3．5 细胞转运通路的稳定性

6．4 讨论

6．4．1 细胞及孵育作用液的选择

6．4．2 Caco-2细胞中的转运通路

6．4．3 HepG2细胞中的转运通路

6．4．4 其他离子的影响及转运通路的稳定性

6．4．5 铜转运通路与小鼠血清自由铜及不同生理效应的关系

6．5 本章小结

第7章 结论与展望

7．1 主要结论

7．2 主要创新点

7．3 研究展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表论文及参与项目

致谢

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