基于糖组学的核心蛋白聚糖的糖胺聚糖结构序列研究

摘要

糖组学代表组学研究的最前沿，也最具挑战性。目前，糖组学的发展未跟上快速发展的基因组学和蛋白组学研究的脚步，主要原因是糖链结构的复杂性及缺乏有效的鉴定糖序列的分析方法。糖基化通常发生在高尔基体和内质网，根据基因组学和蛋白组学方法，不能研究透彻或预测糖基化过程。蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)及其侧链上的糖胺聚糖(glycosaminoglycans，GAGs)是其中一种结构最复杂的糖复合物。2011年Nature子刊Nature Chemical Biology首次发表蛋白聚糖双库尼茨抑制剂(bikunin)的糖胺聚糖全序列结构，也是迄今唯一结构鉴定的糖胺聚糖，本文在此基础上研究结构更复杂的蛋白聚糖核心蛋白聚糖(decorin)的糖胺聚糖全序列结构。
　　核心蛋白聚糖从来源丰富的猪皮中通过柠檬酸钠提取，利用非特异性蛋白酶actinase E完全酶解蛋白质，通过β-消除反应除去还原性末端残留的氨基酸残基，得到糖胺聚糖。应用一系列分析方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶渗透色谱，核磁共振和高效液相色谱-串联质谱鉴定提取的糖胺聚糖纯度和初级结构，并测定其体外抗凝血活性。结果显示decorin糖胺聚糖平均分子量为22kDa，链长范围为聚合度dp14-dp290，平均聚合度为dp92，平均每个二糖重复单元(己糖醛酸-乙酰氨基半乳糖，ΔUA-GalNAc)含有0.98个硫酸根修饰;核磁共振分析显示其含有艾杜糖醛酸(IdoA)和葡萄糖醛酸(GlcA)差向异构体，且积分得其峰面积之比为3∶1;二糖组成分析显示ΔUA(1→3)GalNAc4S含量为94.4mol％，ΔUA2S(1→3)GalNAc4S占4.3mol％,ΔUA(1→3)GalNAc6S占0.1mol％,ΔUA(1→3)GalNAc占0.5mol％;通过抗凝血活性试剂盒测定，decorin GAG的anti Xa活性为3.2U/mg，没有antiⅡa活性，跟临床抗凝血剂肝素相比(200U/mg)，活性相对较低。
　　应用特异性酶结合高效液相色谱-质谱联用的方法分析decorin GAG结构域修饰情况。通过硫酸软骨素酶AC和B完全酶解，分别得到硫酸皮肤素和硫酸软骨素结构域，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，体积排阻色谱和核磁共振鉴定酶解效果;应用top-down方法分析其结构域修饰;HILIC-LC-Orbitrap-MS分析结果显示硫酸皮肤素和硫酸软骨素结构域含有相同的重复二糖寡糖链(dp2-dp20)，区别在于硫酸皮肤素结构域含有更多长链(＞dp20)，而硫酸软骨素结构域含有更多包含还原性末端(GlcA-Gal-Gal-Xyt)的糖链;硫酸软骨素酶ABC完全酶解得到糖胺聚糖链接区域和二糖重复单元，结合bottom-up方法，HILIC-LC-MS分析证实两种最常见的四糖链接区域结构→4)GlcA(l→3)Gal(±4S)（1→3）Gal（1→4）Xylitol存在，且含量超过90mol％;二糖组成分析显示硫酸软骨素结构域中ΔUA(1→3)GalNAc4S，ΔUA(1→3)GalNAc6S，ΔUA(1→3)GalNAc的含量分别是93.2mol％，6.0mol％和0.8mol％，而硫酸皮肤素结构域的二糖则含有95.3mol％的ΔUA(1→3)GalNAc4S和4.7mol％的ΔUA2S(1→3)GalNAc4S。
　　前两章研究主要集中于糖胺聚糖整体修饰情况和平均存在形式，没有涉及每一条独立存在的实际糖胺聚糖结构。根据鉴定bikunin GAG全序列结构的经验，质谱有能力分析每个二糖重复单元含有0.98个硫酸根的糖链，但是当糖链的平均链长达到dp92时则远远超过目前质谱的能力范围。通过色谱方法分离得到带电荷均一分子量小的糖链，再利用制备型电泳分离得到片段用于质谱分析是一种有效的解决办法。取decorin GAG(～800mg)，平均分子量22kDa，通过体积排阻色谱(SEC)-快速液相色谱(FPLC)收集分子量最小的1/3样品，得到MW为19kDa的糖胺聚糖用于强阴离子交换色谱(SAX)-FPLC，收集带电荷均一的中间1/3，再通过SEC-HPLC-RID在线富集得到5mg低分子量带电荷均一的糖胺聚糖用于制备型电泳分离;制备型电泳共得到135个组分，MW介于3kDa至32kDa。通过流动注射法进样，Orbitrap FTMS分析＃38(MW～4.7kDa)至＃60(MW～8.7kDa)的部分组分，得到高分辨率的精确分子量，确定链长及硫酸化程度，共鉴定57条链长介于dp20-dp44之间，硫酸化程度为8-20的不同糖胺聚糖。
　　傅里叶变换-离子回旋共振质谱(FT-ICR MS)分析组分＃39，一级质谱分析提供有效的糖胺聚糖结构信息，并筛选用于MS/MS分析的母离子;CID-FT-ICR MS/MS分析母离子m/z605.3913(dp20-7S)，其糖苷键断裂碎片离子，结合Matlab软件数据处理，用于全序列结构鉴定。串联质谱共鉴定来自＃35，＃39和＃51的12条糖胺聚糖，序列鉴定分析结果显示糖胺聚糖在非还原性末端有均一性，没有证据显示在非还原性末端存在除HexA-GalNAc-S之外的其它二糖组成单元，虽然缺乏C-5空间异构的糖醛酸结构信息，但是一系列高丰度的B和/或C离子证实HexA-GalNAc-S存在，糖胺聚糖以HexA-GalNAc-4S二糖单元形式延长糖链。还原性末端出现硫酸化位点修饰变化，GlcA-GalNAc6S，IdoA2S-GalNAc4S和GlcA-GalNAc二糖单元低频率变化，串联质谱结果显示这些二糖修饰在每条单独链的变化介于0-2次之间;还原性末端靠近GlcA-GalNAc4S-GlcA-Gal-Gal-Xyt链接区域的Y离子证实这些二糖存在，包括IdoA2S-GalNAc4S和GlcA-GalNAc，而跨环断裂碎片也证实6-O只存在于靠近还原性末端的糖链上;跟非还原性末端B离子不同，还原性末端Y离子丰度相对较低，只占2-30％。同时发现这些靠近还原型末端的二糖修饰变化并没有特定排列顺序。
　　综合以上二糖组成，结构域，链长和硫酸化修饰程度，及硫酸根修饰位点等结构分析，最终鉴定decorin GAG在dp14-dp40范围内全序列结构为:
　　从非还原性末端开始[f.GalNAc4S，e.GlcA-GalNAc4S/IdoA-GalNAc4S(25％/75％),d.IdoA2S-GalNAc4S,c.GlcA-GalNAc6S,b.GlcA-GalNAc,a.Hex-GalNAc4S]连接至还原性末端六糖链接区域(GlcA-GalNAc4S-GlcA-Gal-Gal-Xyt)，其中[f=0-1,e=3-20,d=0-1,c=0-1,b=0-1，a=0-3]。

目录

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景及意义

1．2 研究现状

1．2．1 蛋白聚糖

1．2．2 糖胺聚糖

1．2．3 核心蛋白聚糖

1．3 研究路线

1．3．1 糖组学分析工具

1．3．2 基于凝胶电泳的糖链鉴定方法

1．3．3 核磁共振方法鉴定糖序列

1．3．4 X-射线晶体学鉴定糖序列

1．3．5 质谱方法鉴定糖结构

1．3．6 计算机模拟鉴定糖序列

1．3．7 核心蛋白聚糖糖胺聚糖研究路线

第2章 核心蛋白聚糖糖胺聚糖结构初级鉴定及抗凝血活性研究

2．1 概述

2．2．1 实验材料

2．2．2 核心蛋白聚糖提取

2．2．3 糖胺聚糖制备纯化

2．2．5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

2．2．6 凝胶渗透色谱分析

2．2．7 核磁共振鉴定

2．2．8 二糖样品制备及衍生化

2．2．9 液质联用测定二糖组成

2．2．10 体外抗凝血活性分析

2．3 实验结果与分析

2．3．1 核心蛋白聚糖提取

2．3．2 糖胺聚糖链制备

2．3．3 Micro-carbazole assay分析

2．3．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析糖胺聚糖

2．3．5 HPLC-GPC分析糖胺聚糖分子量

2．3．6 核磁共振(NMR)鉴定

2．3．7 二糖分析结果

2．3．8 抗凝血活性分析

2．4 本章小结

第3章 结合Top-down和Bottom-up的方法鉴定糖胺聚糖结构域和链接区域

3．1 概述

3．2 实验材料和方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 硫酸软骨素／硫酸皮肤素结构域制备

3．2．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

3．2．4 体积排阻色谱分析

3．2．5 核磁共振分析

3．2．6 Top-down方法分析CS／DS结构域

3．2．7 生物信息学解谱

3．2．8 核心蛋白聚糖链接区域制备

3．2．9 Bottom-up分析链接区域

3．2．10 LC-MS／MS确定链接区域硫酸化位点

3．2．11 二糖样品制备及衍生化

3．2．12 液质联用分析二糖组成

3．3 实验结果与分析

3．3．1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

3．3．2 体积排阻色谱分析

3．3．3 核磁共振分析

3．3．4 Top-down结果分析

3．3．5 Bottom-up分析链接区域

3．3．6 Orbitrap-FT-MS／MS分析链接区域

3．3．7 结构域二糖组成结果分析

3．4 本章小结

第4章 糖胺聚糖链长及硫酸化程度鉴定

4．1 概述

4．2 实验材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．5 体积排阻-液相色谱(SEC-HPLC)分离糖胺聚糖

4．2．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析

4．2．7 制备型电泳分离

4．2．8 糖胺聚糖含量测定

4．2．9 强阴离子交换色谱除去缓冲盐

4．2．10 液质联用测定二糖单元组成

4．2．11 傅里叶变换质谱(FTMS)分析

4．2．12 数据处理

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 凝胶排阻色谱结果分析

4．3．2 GPC鉴定分离结果

4．3．3 强阴离子交换色谱分离分析

4．3．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

4．3．5 半制备SEC-HPLC分离

4．3．6 制备型电泳分离结果分析

4．3．7 不同链长糖胺聚糖二糖组成分析

4．3．8 糖胺聚糖理论数据库建立

4．3．9 Orbitrap FTMS鉴定糖胺聚糖链长和硫酸化程度

4．4 本章小结

第5章 傅里叶变换离子回旋共振质谱鉴定糖胺聚糖全序列

5．1 概述

5．2 实验材料和方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 纳升级电喷雾-傅里叶变换离子回旋质谱分析

5．2．3 FT-ICR MS／MS分析

5．2．4 MS／MS数据分析

5．2．5 糖胺聚糖全序列结构鉴定

5．3 结果与讨论

5．3．1 FT-ICR MS分析

5．3．2 FT-ICR MS／MS分析

5．3．3 糖链存在数目分析

5．3．4 Decorin GAG结构修饰分析

5．4 本章小结

第6章 结论创新与展望

6．1 全文总结

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附图

附录

致谢

声明