环境因子介导干腌火腿丝状真菌产赭曲霉毒素A的调控机制

摘要

干腌火腿是我国著名的传统肉制品之一，需要经历较长的成熟阶段。适宜的环境因子为丝状真菌生长繁殖提供优良条件，它们可能分泌各种真菌毒素，对人或动物致癌、致突变。低温腌制、中温脱水、高温发酵的自然加工方式一直沿用至今。所以对真菌毒素的安全防控是目前火腿行业面临的重要问题。真菌毒素的生物合成往往受环境因素影响。本文以检测成熟过程干腌火腿真菌毒素残留为研究起点，通过传统培养、高通量测序、宏基因组学及转录组学等手段，模拟火腿高盐发酵体系探究丝状真菌OTA生物合成机制及潜在的渗透胁迫调控因子，为科学指导传统火腿现代化生产，消除或降低真菌毒素积累提供理论依据。
　　主要研究结果和结论如下:
　　(1)建立了干腌火腿的黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、桔青霉素(CIT)、环匹阿尼酸(CPA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)、杂色曲霉素(ST)等9种真菌毒素的QTrap-LC-MS/MS检测方法。在优化条件下，9种真菌毒素在各自的线性响应范围内线性关系良好，相关系数(r)均不小于0.994。在低、中、高三个加标水平下平均回收率为74.5～103.4％，RSD在3.2～14.3％。LOD为0.1～2.5μg/kg,LOQ为0.5～10.0μg/kg。OTA污染严重，外层样品检出率7/25，含量在3.73～128.32μg/kg;内层样品检出率3/25，含量4.23～24.38μg/kg，少量试样检出CIT和CPA。AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，DON均未检出。干腌火腿中OTA的积累与理化性质存在一定的相关性。
　　(2)基于HiSeq高通量测序、宏基因组学解析菌落结构，次级代谢通路及其相关基因功能。鉴定得到的真菌种类归属于2个门，7个纲，11个目，16个科和17个属。发酵前期，Penicillium、Debaryomyces是优势菌群，而发酵中后期Aspergillus占主导。通过RDA分析可知，真菌群落变化与环境因子显著相关。通过宏基因组学测序信息比对KEGG pathway数据库，解析真菌毒素合成相关通路并进行功能注释。共挖掘Unigene112个，编码蛋白33种，参与代谢酶14种，Pathway Entry20条，KO代谢节点10个。
　　(3)从25条干腌火腿中分离215个菌株，通过ELISA和HPLC筛选潜在产生菌，结果表明，共有22个菌株（占10.23％）能够产生OTA。重点考察7株高产菌，经形态学观察和ITS分子鉴定，分别确认为A.ochraceus H1905，A.steynii H1611，A.subramanianiiH2307， A.westerdijkiae H1409, P.brevicompactum H1016, P.chrysogenum H0808,P.verruculosum H1118。
　　(4)研究了温度、NaCl、aw等环境因子对真菌生理及代谢的影响，菌株产孢的最适温度为20～30℃，最适aw为0.95～0.97。曲霉菌偏好温暖的环境，产孢量与aw呈负相关且组间显著性差异(p＜O.05)。当aw0.85、NaCl10％时，P.verruculosum H1118 OTA积累量达320.7μg/kg，而其他曲霉菌则产毒量较少。
　　(5)考察P.verruculosum H1118和A.subramanianii H2307对NaCl胁迫应答，运用RNA-Seq技术挖掘OTA生物合成的转录调控因子。高NaCl(80 g/L)和低NaCl(8g/L)胁迫两个菌株，分别鉴定出1120、1074个差异表达基因。经GO富集分析，H1118 Pv H组参与次级代谢物合成、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、MAP激酶磷酸化等基因上调，这将有利于OTA生物合成。经KEGG分析，NaCl胁迫下H1118 Pv MAPK信号通路中有15个上调基因，3个下调基因。而H2307 As分别仅发现2个和8个，差异表达基因都集中在Sln1-Ypd-Ssk1支路，另三条支路Sho1-Ste11、Hkr/Msb-Cdc42、Opy2-Ste50未发现。NaCl胁迫使H1118 Pv pks、nrps、chl、cyp、pal等OTA合成基因上调，H2307 As关键产毒基因pks、nrps、chl却明显下调。基于RNA-Seq转录组分析，H1118 Pv组氨酸/天冬氨酸激酶Sln1、组氨酸激酶Ypd1、天冬氨酸激酶Ssk1、MAPK激酶Pbs2、Hog1的编码基因均有上调，将激活Hog1发生磷酸化进而调控产毒基因的表达。Hog1是潜在的转录因子，这与H1118 Pv耐受NaCl胁迫的产毒机制密切相关。

目录

摘要

名称缩写

第1章 引言

1．1 赭曲霉毒素A的特性及食品中的限量标准

1．2 传统肉制品中赭曲霉毒素A的存在与分布

1．2．1 传统肉制品中赭曲霉毒素A的发现

1．2．2 传统肉制品中赭曲霉毒素A产生菌的种类

1．3 赭曲霉毒素A的假定生物合成途径及其类似物

1．4 赭曲霉毒素A生物合成相关基因簇

1．4．1 聚合酮酶和非核糖体多肽合成酶

1．4．2 氯代过氧化物酶和细胞色素P450氧化酶

1．5 环境信号对赭曲霉素A生物合成的调控机制

1．6 本课题的研究意义与主要内容

1．6．1 研究背景与意义

1．6．2 主要内容

1．6．3 技术路线

第2章 干腌火腿成熟过程中真菌毒素的动态变化规律

2．1 前言

2．2 材料与设备

2．2．1 实验原材料

2．2．2 试剂与固相萃取柱

2．2．3 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 样品采集

2．3．2 理化指标检验

2．3．3 丝状真菌菌落数计数

2．3．4 真菌毒素检测

2．4 结果与分析

2．4．1 干腌火腿成熟过程中的理化性质及霉菌菌落总数

2．4．2 基于QuEChERS的LC-MS／MS方法学评价

2．4．3 基于LC-MS／MS分析干腌火腿的真菌毒素

2．4．4 干腌火腿理化性质与毒素的相关性分析

第3章 宏基因组学解析干腌火腿真菌群落演替规律及产毒基因功能

3．1 前言

3．2 材料与设备

3．2．1 实验材料

3．2．2 试剂盒

3．2．3 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．2 PCR扩增及质量评价

3．3．3 ITS高通量测序

3．3．4 宏基因组测序

3．4 结果与分析

3．4．1 基于ITS和宏基因组测序的DNA扩增电泳图

3．4．2 基于时间尺度的真菌群落分布多样性解析

3．4．3 基于时间尺度的真菌群落分布差异性解析

3．4．4 基于时间尺度的优势物种注释

3．4．5 环境因子与真菌群落相关性分析

3．4．6 真菌次级代谢产物合成相关的通路与基因功能注释

3．5 小结

第4章 环境因子对干腌火腿产毒真菌生理及代谢的影响

4．1 前言

4．2 材料与设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 化学试剂与培养基

4．2．3 主要设备

4．3 实验方法

4．3．1 菌株分离与培养

4．3．2 ELISA产毒定性分析

4．3．4 形态学和分子生物学鉴定菌株

4．3．5 菌株产孢量测定

4．3．6 环境因子影响菌株产孢与产毒的实验设计

4．4 结果与分析

4．4．1 丝状真菌的分离与培养

4．4．2 产毒丝状真菌的筛选

4．4．3 目标菌株的菌落形态与显微特征

4．4．4 目标菌株的分子生物学鉴定

4．4．5 环境因子对目标菌株产孢量的影响

4．4．6 环境因子对目标菌株产OTA的影响

4．5 小结

第5章 转录组学解析产毒菌株对NaCl胁迫应答的调控因子

5．1 前言

5．2 材料与设备

5．2．1 菌株

5．2．2 培养基与主要试剂

5．2．3 仪器与设备

5．3 实验方法

5．3．1 菌株培养

5．3．2 RNA-seq测序

5．3．3 转录表达水平统计及定量分析

5．4 结果与分析

5．4．1 RNA提取及质量检测

5．4．2 基因转录水平的总体变化

5．4．3 差异表达基因的GO富集分析

5．4．4 差异表达基因的代谢网络功能分析

5．4．5 参与OTA生物合成的差异表达基因

5．4．6 NaCl渗透胁迫下调控因子的转录水平变化

5．5 小结

6．1 主要结论

6．2 主要创新点

6．3 研究展望

参考文献

博士期间发表的论文

致谢

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