鱼源致腐菌荧光假单胞菌群体感应LuxI/LuxR鉴定及生理功能研究

摘要

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）具有较高的蛋白质、脂质水解力，和良好的嗜冷性，是生鱼、肉类和乳制品中重要的革兰氏阴性腐败菌。群体感应是一种细胞间的交流机制，参与毒力因子分泌、生物被膜形成、食品腐败等的调控。现有研究表明希瓦氏菌、气单胞菌、假单胞菌等革兰氏阴性的致腐性与群体感应密切相关，然而，P.fluorescens中AHLs介导的QS系统分子信息及其调控生物被膜、腐败和抗胁迫性的机制的研究较少。鉴于此，本研究以冷藏腐败大黄鱼中分离鉴定的优势腐败菌P.fluorescensPF07为研究对象，采用生物报菌法和高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测PF07中的AHLs活性，利用基因框架测序技术预测PF07全基因组，并对获得的LuxI和LuxR蛋白进行生物信息学分析;构建并验证luxI和luxR基因缺失株，比较研究野生株和缺失株的生长、生物被膜、致腐表型及抗胁迫性差异变化，评价luxI基因缺失株中外源添加C4-HSL的影响;基于转录组学测序技术研究luxI和luxR基因缺失对P.fluorescens 的基因表达及代谢通路的影响，旨在更加全面地了解致腐菌LuxI和LuxR系统，为研发新型食品保鲜剂提供理论支持。主要结果如下: 研究发现P.fluorescens PF07上清液中含有C4-HSL、C10-HSL和C14-HSL三种信号分子，且C4-HSL含量最高。PF07基因框架测序显示，预测全基因组大小约为6.59Mb，编码基因约5573个，长度约为5，352，570 bp。PF07中预测出的ncRNA有3种（tRNA，rRNA和sRNA），Prophage有6个，CRISPRs有70个，次级代谢产物基因簇6种，其中hserlactone (homoserine lactone)是与群体感应相关的基因簇。采用COG聚类分析PF07功能时，从Signal transduction mechanism 类型的基因中发现群体感应相关的合成酶GM004424 (LuxI)和受体蛋白GM004425 (LuxR)。两个蛋白的生物信息学分析发现，PF07中LuxI/LuxR与荧光假单胞菌PFuk4中同源蛋白具有高度的同一性和相似性，并且与其他菌株中六种LuxI型合成酶和LuxR受体蛋白具有相同的保守氨基酸和相似的蛋白质3D结构，因此认为PF07中LuxI/LuxR是一对同源的群体感应合成酶和受体蛋白。 构建了P.fluorescensPF07luxI 和 luxR基因缺失株，比较分析野生株及两株突变株ΔluxI/ΔluxR在生物被膜形成、致腐能力和抗胁迫性间的差异，并评价C4-HSL添加对ΔluxI的影响。结果发现，缺失株ΔluxI中C4-HSL几乎散失，ΔluxR 中降低约38.60％，但对C10-HSL和C14-HSL活性无影响。在30℃和4℃下luxI和luxR基因缺失对细菌生长无影响，分别在18h和144 h达到稳定期。luxI和luxR基因缺失都导致生物被膜的形成减弱，且降低细菌的粘附能力及胞外多糖形成量，却促进细菌泳动性。ΔluxI和ΔluxR在30℃下被膜结晶紫量分别降低17.22％和14.56％，而4℃分别减少27.51％和22.48％; C4-HSL部分回补被膜含量，30℃和4℃下最高分别回复12.82％和23.66％。CLSM显示两种温度下Δluxl和ΔluxR形成的被膜都更薄且结构较疏松，SEM观察到ΔluxI和ΔluxR胞外分泌物减少。luxI和luxR基因缺失也降低菌体胞外蛋白酶和嗜铁素的产生，特别是蛋白酶活性，最高时分别降低了11.94％和12.51％，但不影响TVB-N含量。外源添加C4-HSL可部分恢复ΔluxI中嗜铁素和蛋白酶的缺陷，其中对蛋白酶作用较弱，最高仅能恢复9.2％。此外ΔluxI和ΔluxR在20 mM H2O2、30％ (m/v) NaCl、50℃和150μg/mL结晶紫中的抗胁迫力弱于野生株，其中H2O2处理三者间差异最大，野生株的存活率分别是ΔluxR和ΔluxI的15.31倍和18.71倍。 转录组学分析显示，P.fluorescensPF07中LuxI/LuxR敲除会影响多种生物被膜相关的基因，包括下调多糖相关的基因、上调pst系统相关的基因，ΔluxR中还上调PhoB/U双组分系统。而对pst系统与PhoB/U双组分系统基因上调，可能导致下调细胞内c-di-GMP含量，从而促进细胞的泳动性。同时，两个缺失株ΔluxI和ΔluxR中参与胞外蛋白酶产生(aprX)，嗜铁素生物合成(ornithine monooxygenase)和应激反应（rpos、OmsC、HslV)基因的下调。还有在ΔluxR 和ΔluxI中其他与腐败相关基因的表达水平也下调，如脂质代谢，硫化合物代谢，芳香族化合物和氨基酸代谢，异味产生等;LuxR在ΔluxI中的表达水平下调。外源添加C4-HSL仅恢复ΔluxI的部分基因，如与嗜铁素合成相关的基因ornithine monooxygenase、与多糖合成相关的基因polysaccharide biosynthesis protein，与绿脓素产生相关基因pyocin R2 holin，与应激反应相关基因osmC，hslV等。采用荧光定量PCR，研究验证aprX、flihA、luxI、luxR、orm、pbp和rpoS基因在四组菌中表达量的变化，其结果与转录组测序基本一致，且都能映证表型变化的结果，证明转录组测序结果较为可靠。 研究表明，LuxI/LuxR是荧光假单胞菌PF07中一对同源的群体感应合成酶和受体蛋白，且LuxI/LuxR能通过上调多糖相关的基因、下调pst系统相关基因及PhoB/U双组分系统基因来促进生物被膜的形成，上调胞外蛋白、嗜铁素、脂质代谢等腐败相关基因来促进腐败，以及上调应激反应相关基因来提高其抗胁迫性。从生理表型和基因表达差异变化，证实了群体感应LuxI/LuxR对荧光假单胞菌被膜形成、致腐能力以及抗胁迫性的正向调节作用。

目录

摘要

第一章绪论

1．1生鲜食品中的腐败菌

1．1．1食品腐败菌类型

1．1．2荧光假单胞菌

1．2革兰氏阴性菌与群体感应

1．2．1群体感应

1．2．2自诱导物、合成酶、受体及特异性

1．2．3群体感应与食品腐败

1．2．4群体感应与细菌生物被膜形成

1．2．5群体感应与细菌抗胁迫性

1．3假单胞菌中的群体感应

1．3．1铜绿假单胞菌中的群体感应

1．3．2荧光假单胞菌中的群体感应

1．3．3其他假单胞菌中的群体感应

1．4本课题的研究目的、意义和内容

第二章荧光假单胞菌PF07基因组中LuxI／LuxR生物信息学分析

2．1 前言

2．2材料与设备

2．2．1菌株及培养条件

2．2．2试剂

2．2．3主要仪器设备

2．3试验方法

2．3．1 报告菌法和LC／MS-MS检测P．fluorescens PF07信号分子活性

2．3．2菌体的培养与收集

2．3．3总DNA的提取及全基因组测序

2．3．4文库构建与质检

2．3．7 P．fluorescens PF07 LuxI／LuxR基因PCR扩增

2．3．8 LuxI／LuxR同源性、保守位点分析及三维结构模拟

2．4数据处理和分析

2．5结果分析

2．5．1 报告菌法分析PF07信号分子活性

2．5．2 LC／MS-MS检测P．fluorescens PF07信号分子活性

2．5．2 DNA文库构建与测序质量评估

2．5．3 P．fluorescens PF07基因组组分分析

2．5．4 P．fluorescens PF07基因功能分析

2．5．5 PCR验证P．fluorescens PF07中LuxI与LuxR基因

2．5．6 LuxI／LuxR进化树、保守位点分析及三维结构模拟

2．7讨论

第三章LuxI／LuxR缺失对PF07生物被膜、致腐及抗胁迫力的影响

3．1 前言

3．2材料与设备

3．2．1材料、菌株及培养条件

3．2．2试剂

3．2．3主要仪器设备

3．3实验方法

3．3．1 LuxI及LuxR缺失株的构建

3．3．2 LuxI及LuxR缺失株基因缺失验证

3．3．5野生株和缺失株的生物被膜形成能力测定

3．3．6野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力测定

3．3．7野生株和缺失株抗胁迫力的测定

3．5．2 生物报告菌法和LC-MS／MS检测野生株和缺失株AHLs活性

3．5．3 野生株和缺失株的生长

3．5．4野生株和缺失株生物被膜形成比较

3．5．6野生株和缺失株抗胁迫力比较

3．5．5野生株和缺失株在鱼汁中腐败能力比较

3．6讨论

第四章基于转录组学分析LuxI／LuxR对PF07生理功能调控的机制

4．1前言

4．2材料与仪器

4．2．1主要试剂和培养基

4．2．2主要仪器

4．3转录组学测序

4．3．1细菌培养及样品制备

4．3．2样品总RNA提取纯化及质量检测

4．3．3文库构建与测序

4．3．4质量控制与参考基因组比对分析

4．3．5基因表达水平分析及差异基因筛选

4．3．6差异基因筛选

4．3．7差异表达基因的GO富集

4．3．8差异表达基因的KEGG pathway富集

4．4荧光定量PCR验证

4．4．1样品总RNA提取

4．4．2总RNA反转录

4．4．3荧光定量PCR

4．5数据处理和分析

4．6结果与分析

4．6．1转录组reads质量与统计分析

4．6．2差异基因表达分析

4．6．3差异基因聚类分析

4．6．4差异表达基因GO富集分析

4．6．5差异表达基因KEGG Pathway富集分析

4．6．6差异表达基因分类整理

4．6．9荧光定量PCR验证

4．6．10群体感应LuxI／LuxR调控机制模拟图

4．7讨论

5．1总结

5．2创新点

5．3展望

参考文献

致谢

附录

声明