小分子伴侣的制备及其协助基因工程蛋白体外重折叠的初步研究

摘要

首先根据载体的特性,我们选择了大肠杆菌BL21作为宿主细胞.在将质粒导入大肠杆菌后,根据小分子伴侣的分子量18kDa和其六聚组氨酸尾能够亲和吸附到Ni-NTA的特性进行了初步鉴定,并根据小分子伴侣表达量的大小选定了菌种.然后对培养基的种类、组成和培养条件中各项主要因素进行了考察.在基本培养基的选择时,发现携带小分子伴侣基因的工程菌在含有无机盐和碳源的M9培养基中培养能够显著提高小分子伴侣的表达量,在确定M9为基本培养基之后,对其主要成分进行了优化,同时,考察了发酵温度、供氧量、诱导条件等对目标蛋白表达量的影响,在摇瓶培养中将发酵产量提高到了556.3mg/L.在转速为6000rpm的条件下收集发酵液中的细胞,用缓冲液将其重新悬浮后,超声波破碎,离心取上清,根据小分子伴侣N末端的His<,6>-Tag的特性进行了Ni-NTA亲和层析.在层析过程中,对其吸附和洗脱进行了咪唑梯度的考察,实现了一步纯化.纯化后的产品用凝胶层析进行了纯度检测,并用MALDI-TOF-MS验证了纯化后产品的分子量18kDa.最后以基因工程药物重组人IFN-γ作为底物蛋白,对游离小分子伴侣协助蛋白质复性过程中的主要影响因素进行了初步探讨,结果表明IFN-γ在最终浓度为0.22mg/ml的稀释复性中,加入摩尔量为5倍的游离小分子伴侣,可以使其复性效率提高将近10倍,该方法进而可应用于其它基因工程产物及抗体、疫苗等的复性之中.

目录

文摘

英文文摘

绪论

第一章文献综述

1.1包涵体的形成

1.2包涵体复性过程

1.2.1包涵体的分离

1.2.2包涵体的溶解

1.2.3包涵体的复性

1.2.4蛋白质复性后的检测

1.3分子伴侣协助的包涵体复性

1.3.1分子伴侣的概念

1.3.2分子伴侣协助复性应用

1.3.3分子伴侣协助复性的机理

1.4.小分子伴侣

1.4.1小分子伴侣简介

1.4.2小分子伴侣的结构

1.4.3小分子伴侣协助蛋白质复性的研究

1.5本文的研究内容

第二章质粒转化及菌种筛选

2.1实验材料和仪器

2.1.1质粒和菌株

2.1.2培养基

2.1.3溶液

2.1.4实验仪器

2.2实验方法

2.2.1质粒抽提

2.2.2感受态细胞的制备

2.2.3质粒转化

2.2.4转化子筛选

2.2.5菌种保存

2.3实验结果及讨论

2.3.1宿主细胞的选择

2.3.2菌种的筛选

2.3.3转化成功的检测

2.4小结

第三章重组大肠杆菌BL21发酵过程研究

3.1实验材料和仪器

3.1.1菌种

3.1.2培养基

3.1.3实验仪器

3.2分析方法

3.2.1考马斯亮兰法测蛋白质浓度

3.2.2细胞生长测定

3.2.3小分子伴侣表达量测定

3.3实验方法

3.4实验结果与讨论

3.4.1种子培养基的选择

3.4.2基本发酵培养基的选择

3.4.3基本培养条件的确定

3.4.4培养基的优化

3.4.5种龄和接种量对发酵的影响

3.4.6渗透压对目标蛋白表达的影响

3.4.7温度对表达的影响

3.4.8溶氧量对蛋白质表达的影响

3.4.9诱导条件

3.4.10优化后的目标蛋白表达情况

3.5小结

第四章小分子伴侣蛋白的纯化

4.1实验材料和仪器

4.1.1缓冲溶液

4.1.2凝胶

4.1.3主要实验仪器

4.2实验方法

4.2.1细胞离心破碎

4.2.2亲和层析

4.2.3凝胶层析

4.2.4收率的计算

4.2.5质谱法测定小分子伴侣分子量

4.3实验结果及讨论

4.3.1细胞破碎条件

4.3.2亲和层析条件摸索

4.3.3亲和层析条件的确定

4.3.4质谱法确定小分子伴侣分子量

4.4小结

第五章分子伴侣协助γ-干扰素体外复性的初步研究

5.1实验材料和仪器

5.1.1人γ-干扰素菌种

5.1.2包涵体复性中所用溶液

5.1.3细胞治病效应抑制微量测定法所用培养基和溶液

5.1.4主要实验仪器

5.2重折叠γ-干扰素的活性检测方法

5.2.1攻击病毒VSV的扩增

5.2.2 VSV效价滴定

5.2.3细胞致病效应(CPE)抑制微量测定法

5.2.4 IFN-γ效价计算方法

5.3实验方法

5.3.1 γ-干扰素包涵体的制备

5.3.2包涵体的洗涤与纯化

5.3.3包涵体的化学变性溶解

5.4.4包涵体的游离复性

5.4实验结果和讨论

5.4.1包涵体的制备

5.4.2包涵体的洗涤和纯化

5.4.3包涵体的溶解

5.4.4 IFN-γ包涵体在游离小分子伴侣协助下的复性

5.5小结

结论

参考文献

致谢